流感病毒M2蛋白與宿主熱休克蛋白Hsp40的相互作用研究.pdf

1、流感病毒包含四種膜整合蛋白：HA、NA、M1和M2。甲型流感病毒A/M2蛋白具有離子通道的活性，可以將質(zhì)子泵入內(nèi)體，從而激活膜融合過程。在病毒的脫殼過程中，A/M2能夠促進病毒核蛋白NP與M1的解離。與A/M2相似，在蟾蜍和哺乳動物細胞中表達乙型流感病毒的BM2蛋白，能夠使細胞酸化，這表明BM2也具有離子通道功能，可能在病毒脫殼過程中起著降低內(nèi)體pH值的作用。利用反向遺傳技術(shù)對BM2的研究表明，BM2是乙型流感病毒復(fù)制所必需的。由此可見

2、，流感病毒M2蛋白在病毒整個生命周期中起著重要作用，同時其很長的胞內(nèi)區(qū)域也暗示其發(fā)揮著重要的作用，但如何起作用，有哪些細胞因子參與了這個作用過程，目前還不清楚。本研究組以BM2胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)從人腎臟文庫中分離到了一個與BM2相互作用的宿主蛋白一熱休克蛋白40(heat shockprotein 40，Hsp40/Hdj1)。本研究在已有的工作基礎(chǔ)上，將表達BM2的誘餌質(zhì)粒和表達Hsp40的文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細胞，證

3、明了Hsp40和BM2在酵母菌中的相互作用，并通過GSTpull-down和免疫共沉淀實驗進一步驗證了二者在體內(nèi)和體外的相互作用。BM2與Hsp40的缺失突變體的體外結(jié)合實驗表明，BM2是與Hsp40的CTD1結(jié)構(gòu)域結(jié)合。通過GSTpull-down和免疫共沉淀實驗首次證明了Hsp40不僅與BM2相互作用，也能與A/M2相互作用。 已有研究表明，Hsp40能與PKR信號通路的負(fù)調(diào)控因子P58<'IPK>結(jié)合而激活PKR信號途徑，

4、但是流感病毒感染細胞后，Hsp40-P58<'IPK>復(fù)合體可發(fā)生解離。PKR是宿主抗病毒感染的防御反應(yīng)中的重要因子，能夠通過結(jié)合雙鏈RNA而發(fā)生自動磷酸化活化，從而進一步活化它的底物一真核翻譯起始因子2的α亞基(elF-2α)，發(fā)揮抑制蛋白合成的功能。因此我們試圖去闡明M2、Hsp40和P58<'IPK>三者的關(guān)系以及M2蛋白在PKR信號調(diào)節(jié)中的作用。我們的結(jié)果顯示，可溶性重組蛋白GST-BM2不能競爭性抑制Hsp40與P58<'IP

5、K>的結(jié)合，而是增強二者的結(jié)合。GST pull-down和免疫共沉淀實驗也表明無論是A/M2還是BM2都能與P58<'IPK>相互作用，這暗示M2、Hsp40和P58<'IPK>三者可能形成一個穩(wěn)定的復(fù)合體。更重要的是純化的BM2蛋白在體外能夠增強PKR的自磷酸化活性，在293細胞中過表達A/M2或BM2也能增強PKR的磷酸化水平。 本研究首次發(fā)現(xiàn)了M2蛋白能夠參與PKR信號通路的調(diào)控。在病毒感染的后期表達的M2蛋白可能通過與