輪狀病毒與宿主細胞相互作用的研究.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒屬，是一種無包膜的二十面體形狀病毒。RV衣殼由三層同心包裹的結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，核心含有一個由11個雙鏈RNA片段構(gòu)成的基因組，后者編碼12個病毒蛋白，包括6個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-4，6，7)和6個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-6)。輪狀病毒具有嚴格的細胞嗜性，只能有效感染胃腸道上皮及腎上皮細胞。人和動物的嬰幼個體對輪狀病毒普遍易感。然而，隨著年齡的增大，他們對RV的易感性也顯著降低。產(chǎn)生這種變化的原因

2、可能是在個體的生長過程中，針對RV的某些宿主限制性細胞因子出現(xiàn)了表達。目前許多研究表明一些宿主蛋白例如APOBEC3G、Lv1、Ref1及EWI-2wint具有明顯的抑制病毒感染的作用，而這些宿主限制性因子的表達可增加宿主對病毒的抵抗能力，降低宿主的易感性。然而，在RV感染中，類似的具有抑制RV感染的宿主蛋白卻少有發(fā)現(xiàn)。如同在其它很多的病毒感染，在RV感染中，宿主蛋白的合成受到了廣泛的抑制。但是有研究發(fā)現(xiàn)，一些宿主蛋白如整合素α2β1、

3、β2及伴侶蛋白Grp78、Grp94在RV感染過程中表達上調(diào)，并在RV的復制過程中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明RV能夠選擇性促進某些宿主蛋白的表達以保證病毒感染的順利進行。相反，宿主細胞是否同樣可以通過上調(diào)一些抗RV的宿主蛋白的表達以抑制RV的感染呢?
　　 RV感染是導致全球范圍內(nèi)5歲以下嬰幼兒急性脫水腹瀉的主要原因。RV腹瀉發(fā)生的確切的分子機制到目前為止仍然沒有定論。最初RV腹瀉被認為是由于小腸絨毛頂部腸上皮細胞被RV感染后生

4、理功能受到破壞引起的。一些體外實驗研究表明RV感染可以引起腸上皮細胞的凋亡和壞死。在對RV腹瀉動物模型的研究中進一步發(fā)現(xiàn)RV感染可以導致小腸粘膜發(fā)生病理改變及功能異常，其程度的輕重取決于。RV病毒株的毒力。然而，這種機制難以解釋為什么在RV腹瀉中常常發(fā)現(xiàn)腸道粘膜只有輕微的組織病理學改變且沒有腸上皮細胞的破壞的現(xiàn)象。其它一些研究發(fā)現(xiàn)，RV感染后腸上皮細胞刷狀緣相關(guān)的一些酶如蔗糖酶異麥芽糖酶(SI)、乳糖酶-根皮苷水解酶，二肽基肽酶Ⅳ(DP

5、PⅣ)、Na+-D-葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(SGLT1)以及Na+L-丙氨酸轉(zhuǎn)運體的表達及活性的出現(xiàn)損害，由此推測RV感染導致腸上皮細胞對葡萄糖和氨基酸的消化吸收能力減弱可能是RV感染引起腹瀉發(fā)生的一種可能的機制。但是這些研究都未能給出一個被廣泛接受的RV感染引起腹瀉發(fā)生的具體的分子機制。
　　 近年來，蛋白質(zhì)組技術(shù)被廣泛應用于病毒感染的研究之中，這對揭示病毒感染的病理生理機制，深化我們對病毒-宿主相互作用的認識發(fā)揮了巨大作用。在本研究

6、中，我們通過蛋白質(zhì)組技術(shù)來發(fā)現(xiàn)新的RV宿主限制性因子以及探究RV腹瀉的新機制。本研究分為兩部分，第一部分采用二維凝膠電泳(2-DE)等技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的RV宿主限制因子，觀察宿主細胞的天然免疫機制是如何應對RV感染的；第二部分則運用一種先進的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)SILAC來研究RV感染腸上皮細胞引發(fā)腹瀉的分子機制，觀察RV是如何破壞宿主的天然免疫屏障從而致病的。本研究將會加深對RV感染及RV與宿主細胞相互作用分子機制的認識，為RV腹瀉的預防和治療

7、提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分：新的RV宿主限制性因子發(fā)現(xiàn)
　　 首先，我們確定了RV感染的合適時間和MOI以獲得最好的感染效果和細胞活力，這對隨后的二維凝膠電泳分析十分重要。為進行二維凝膠電泳樣本的制備，我們將MA104培養(yǎng)在直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中，當細胞完全匯合時，用用純化的人輪狀病毒W(wǎng)a株感染(moi=3)，同時用等量的DMEM作為對照感染。細胞感染12后用冷0.9％NaCl沖洗感染的細胞，蛋白裂解液提取細胞總

8、蛋白。采用13 cm ReadyStrip IPG膠條(非線性，pI3-10)在IPGphor電泳系統(tǒng)上進行蛋白質(zhì)的等電聚焦。等電聚焦結(jié)束后，將膠條置于預先制好的12.5％聚丙烯酰胺凝膠上垂直電泳以進行多肽分離。電泳結(jié)束后，用膠體藍對凝膠進行染色，并采用GS800掃描儀對染色后的凝膠進行掃描，用PDQuest6.1軟件進行圖像分析。我們選擇RV感染后表達顯著上調(diào)50％以上的蛋白點，通過MALDI-TOF-MS進行蛋白序列鑒定。結(jié)果顯示在

9、人RV Wa株感染的MA104細胞中共發(fā)現(xiàn)24個蛋白點的表達顯著上調(diào)50％以上，質(zhì)譜成功鑒定了其中16個蛋白點。在成功鑒定的蛋白點中，11個為宿主蛋白(10種)，5個點為病毒蛋白(4種)。我們隨機選取了一些宿主蛋白如ACP1、ALDOA、CYPA和KRT20對它們的表達采用Western blot和qRT-PCR等方法進一步驗證。
　　 其次，為了明確CYPA在RV感染中的作用，我們先進行了免疫熒光實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在RV感染MA1

10、04細胞后，CYPA與RV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5出現(xiàn)顯著共定位，提示CYPA被招募到RV病毒粒質(zhì)。繼而我們通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，RV結(jié)構(gòu)蛋白VP2與CYPA能夠相互共沉淀，表明這兩種蛋白質(zhì)可能存在直接或間接的相互作用。在此基礎(chǔ)上為了進一步明確CYPA是否對RV感染有抑制或促進作用，我們在宿主細胞內(nèi)過表達野生型CYPA及其脯氨酰順反異構(gòu)酶功能缺失突變體CYPA/R55A，或干擾宿主細胞內(nèi)源性CYPA的表達，觀察這些處理對RV感染的影響。結(jié)果

11、顯示，過表達野生型CYPA顯著降低RV復制，而過表達CYPA/R55A會顯著促進RV復制。降低內(nèi)源性CYPA表達同樣顯著促進RV的復制。這些結(jié)果顯示CYPA可以通過其脯氨酰順反異構(gòu)酶活性抑制RV復制。同時，過表達CYPA及其酶功能缺失突變體CYPA/R55A均能降低宿主對RV的易感性。進一步研究發(fā)現(xiàn)CYPA還可以通過促進宿主細胞IFN-I反應來抑制RV感染，這種功能不依賴于其脯氨酰順反異構(gòu)酶活性但是可能依賴于宿主細胞JNK信號路徑的激活

12、。
　　 最后，由于新生BALB/c小鼠對RV非常易感，RV感染容易產(chǎn)生腹瀉癥狀。隨著日齡的增大(>2周)BALB/c小鼠對RV易感性顯著降低。為了明確小腸上皮細胞CYPA的表達是否與BALB/c小鼠對RV易感性的變化相關(guān)，我們比較了不同日齡段BALB/c小鼠小腸上皮細胞中CYPA的表達，發(fā)現(xiàn)在新生小鼠(5日齡)CYPA僅在小腸絨毛底部，主要是在腸隱窩處上皮細胞中有少量表達，而在RV容易感染到的小腸絨毛上部的上皮細胞中幾乎不見C

13、YPA的表達。相反，在稍大的BALB/c小鼠(15日齡)的小腸絨毛，不管是絨毛頂端還是基底部，其上皮細胞中CYPA均有豐富的表達。這些結(jié)果表明，新生BALB/c小鼠小腸絨毛上段上皮細胞中CYPA表達缺失可能是導致其對RV易感的重要原因。
　　 第二部分：RV感染腸上皮細胞引發(fā)腹瀉新機制的發(fā)現(xiàn)
　　 首先，我們用人輪狀病毒(Wa株)感染人腸上皮細胞Caco-2，同時在培養(yǎng)基中加入100μg/ml胰蛋白酶，以此模擬腸道消化性

14、的環(huán)境，觀察腸腔內(nèi)消化性環(huán)境對RV感染腸上皮細胞后果的可能影響。實驗發(fā)現(xiàn)，在消化性環(huán)境中RV的感染會導致腸上皮細胞
　　 快速脫落。臺盼藍染色表明脫落的細胞活性良好，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示這些脫落的細胞在脫落時沒有出現(xiàn)明顯的凋亡或壞死。在非消化性環(huán)境下腸上皮細胞只會在RV感染的末期才出現(xiàn)明顯的脫落，此時脫落細胞幾乎全部凋亡及壞死。結(jié)果提示，體內(nèi)RV感染中，被感染的腸上皮細胞可能還沒有來的及凋亡或壞死或其它明顯功能損害就已經(jīng)從基底膜脫

15、落，徹底失去功能。我們進一步檢測了小腸內(nèi)不同段腸腔內(nèi)的胰蛋白酶的活性，結(jié)果顯示在BABL/c小鼠幼仔的空腸中、下段和回腸的上段胰蛋白酶活性最高。此外，通過結(jié)晶紫對BABL/c腸上皮細胞進行活體染色發(fā)現(xiàn)，RV感染引起的腸上皮細胞脫落在上述腸段中最為明顯。我們的結(jié)果提示RV感染導致腸上皮細胞在腸道消化性環(huán)境中快速脫落可能才是RV腹瀉產(chǎn)生的根本原因。
　　 其次，為了尋找消化性環(huán)境中RV感染引腸上皮細胞快速脫落的直接原因，我們采用了一

16、種定量蛋白質(zhì)組學方法-細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素氨基酸標記(SILAC)來分析RV感染后Caco-2細胞蛋白表達譜的變化。結(jié)果顯示，RV感染顯著削弱了與細胞間的粘附相關(guān)蛋白以及細胞與細胞外基質(zhì)的粘附相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達，如E-caherin，Plakoglobin，Desmoplakin，層粘連蛋白B2，纖維連接蛋白1，Plectin1，Cingulin以及ZO-1等。Western blot及qRT-PCR進一步證實了這些蛋白質(zhì)在RV感染后顯著

17、下降。免疫熒光實驗進一步驗證了RV感染引起細胞間連接包括緊密連接，粘附連接以及橋粒連接的嚴重損壞。進一步通過結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)，RV感染顯著破壞腸上皮細胞屏障功能，增大細胞間隙，導致胰蛋白酶向細胞底部嚴重滲漏，從而破壞細胞.細胞外基質(zhì)粘附，最終引起上皮細胞脫落。
　　 最后，為了明確RV感染導致細胞粘附功能破壞從而引起腸上皮細胞脫落的的相關(guān)信號機制，我們對RV感染中可能涉及到的激酶和磷酸酶與細胞脫落之間的關(guān)系進行了研究。我們發(fā)現(xiàn)抑制

18、酪氨酸蛋白激酶可以顯著抑制消化性環(huán)境中RV感染引起的腸上皮細胞的脫落，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶則顯著促進RV感染及感染的腸上皮細胞的脫落。抑制蛋白酶磷酸2A(PP2A)同樣顯著促進RV感染引起腸上皮細胞的脫落。此外，免疫印跡法顯示RV感染引起PP2A兩個主要結(jié)構(gòu)亞單位PPP2R1A和PPP2R1B表達減少。RV感染可以引起細胞胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，我們結(jié)果顯示，通過離子霉素和毒胡蘿卜素增大胞漿Ca2+濃度加速RV感染引起的細胞脫落。然而，

19、使用BAMPT-AM和U73122抑制胞漿內(nèi)Ca2+增加卻不能阻止消化性環(huán)境中RV感染引起的腸上皮細胞的快速脫落。這表明RV感染引起胞漿Ca2+的增加只是導致宿主細胞的脫落促進因素而非決定因素。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CYPA是一種新的抗RV感染的宿主限制性因子。CYPA通
　　 過本身的脯氨酰順反異構(gòu)酶活性抑制RV的復制，其在腸上皮細胞中的表達可能與宿主對RV的易感性密切相關(guān)。CYPA同時還可以通過介導宿主細胞IF

20、N-I反應來抑制RV感染。CYPA的這種功能不依賴于其脯氨酰順反異構(gòu)酶活性，而可能依賴于宿主細胞中JNK信號通路的激活。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)在消化性環(huán)境中RV感染會導致腸上皮細胞快速脫落，這種現(xiàn)象可能才是RV腹瀉產(chǎn)生的真正原因。而造成細胞脫落的原因與RV感染引起腸上皮細胞粘附功能及屏障功能的破壞，胰蛋白酶滲透到細胞基底部破壞細胞與細胞外基質(zhì)的粘附密切相關(guān)。在這個過程中，RV感染引起的酪氨酸蛋白激酶的激活以及PP2A的抑制起到了關(guān)鍵作用，而