自噬在衰老自發(fā)性高血壓大鼠足細胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　觀察正常血壓衰老及高血壓衰老時大鼠腎皮質RAS及腎小球足細胞自噬的變化，進一步探討高血壓衰老時腎損傷的可能機制，然后用血管緊張素轉換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)貝那普利和AngⅡ受體拮抗劑(AngⅡ receptor blockers，ARB)氯沙坦分別干預老年自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR

2、)，觀察貝那普利和氯沙坦對老年SHR腎小球足細胞自噬的影響，進一步探討ACEI/ARB腎臟保護作用的新機制。
　　方法：
　　(1)正常血壓大鼠Wistar-Kyoto-rat(WKY)分為3、13、22月齡組，均有性別、月齡、數量相匹配的SHR作為對照。監(jiān)測大鼠血壓;檢測尿蛋白、尿肌酐、血肌酐(serum creatinine，SCR)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清和腎皮質腎素活性、An

3、gⅡ水平;觀察腎組織光鏡、透射電鏡下形態(tài)學改變，計數足細胞內自噬體;western blot法檢測腎小球AngⅡ1型受體(AngⅡtype1 receptor,ATIR)、AngⅡ2型受體(AngⅡtype2 receptor,AT2R)、nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達情況。
　　(2)18月齡雄性WKY為NORM組[生理鹽水2ml/d]，18月齡雄性SHR隨機分為4組:CTRL組[生理鹽水2m

4、l/d]、ACEI組[貝那普利10mg/(kg.d)]、ARB組[氯沙坦30mg/(kg.d)]、Combined組[貝那普利10mg/(kg.d)+氯沙坦30mg/(kg.d)]，每組均為6只，實驗干預4個月。定期監(jiān)測大鼠血壓;實驗終點檢測尿蛋白、尿肌酐、SCR、BUN、血清及腎皮質腎素活性、AngⅡ水平;觀察腎組織光鏡和電鏡下形態(tài)學改變，計數足細胞內自噬體;western blot法檢測腎小球nephrin、Beclin1、LC3B

5、-Ⅱ、Atg5和p62蛋白表達情況。
　　結果：
　　(1) WKY及SHR血壓隨著月齡增加均無明顯變化(P＞0.05)，但SHR血壓均明顯高于同月齡WKY(P＜0.05)。
　　(2)正常血壓衰老及高血壓衰老時，尿蛋白/尿肌酐比值均明顯升高（均P＜0.05）SHR尿蛋白/尿肌酐比值均明顯高于同月齡WKY(P＜0.05)。
　　(3)正常血壓衰老及高血壓衰老時，SCR、BUN水平均無明顯變化（均P＞0.05）;兩

6、組比較，僅3月齡、13月齡SHR的BUN水平分別明顯高于同月齡WKY（均P＜0.05）。
　　(4)正常血壓衰老時，血清及腎皮質腎素活性、AngⅡ水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）;高血壓衰老時，血清及腎皮質腎素活性、血清AngⅡ水平隨增齡差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但腎皮質AngⅡ水平隨增齡明顯降低(P＜0.05)。
　　(5)正常血壓衰老及高血壓衰老時腎臟均出現腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化等衰老病變，但

7、以高血壓衰老時病變更為嚴重;正常血壓衰老時腎小球足細胞自噬體相對堆積。
　　(6)正常血壓衰老時腎小球AT1R、AT2R、Beclin1蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表達明顯增多（均P＜0.05）;高血壓衰老時腎小球AT1R蛋白表達明顯增多，AT2R、nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表達明顯減少（均P＜0.05）。
　　(7)藥物干預后，4組SHR血壓

8、、尿蛋白/尿肌酐比值仍明顯高于NORM組，但ARB組、Combined組血壓、尿蛋白/尿肌酐比值明顯低于CTRL組(均P＜0.05)。
　　(8)藥物干預后，各組SCR、BUN差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。
　　(9)藥物干預后，CTRL組、Combined組腎皮質腎素活性明顯低于NORM組（均P＜0.05）;Combined組血清AngⅡ水平明顯高于CTRL組（均P＜0.05）;4組SHR腎皮質AngⅡ水平明顯低于N

9、ORM組，ARB組腎皮質AngⅡ水平明顯高于CTRL組(均P＜0.05)。
　　(10)藥物干預后，4組SHR均可見腎小球缺血皺縮，足突融合、消失，灶性小管萎縮及間質纖維化，但以CTRL組病變較重，Combined組病變較輕，NORM組、Combined組足細胞內自噬體明顯多于CTRL組(均P＜0.05)。
　　(11)藥物干預后，CTRL組nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平明顯低于NORM組

10、;ACEI組nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5水平、ARB組和Combined組nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平均明顯高于CTRL組(均P＜0.05)。
　　討論：
　　(1)本實驗無論是正常血壓衰老的WKY還是高血壓衰老的SHR在結構上均出現腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化等衰老病理變化，但明顯的SHR病變更加嚴重;功能上，WKY和SHR隨著月齡的增加尿蛋白/尿肌酐比

11、值明顯上升，且SHR尿蛋白/尿肌酐比值明顯高于同月齡WKY，說明衰老是腎臟結構變化、功能衰退的因素之一，而高血壓則加重了這些衰變。
　　(2)正常血壓衰老時腎小球LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達明顯上升，高血壓衰老時腎小球Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達明顯下降，電鏡所見正常血壓衰老時腎小球足細胞自噬體堆積，說明WKY腎小球足細胞隨增齡細胞內自噬體有所堆積，自噬活性是下降的，SHR腎小球足細胞自噬活性相對升高。

12、
　　(3)高血壓衰老時腎小球nephrin表達明顯少于同月齡WKY，電鏡可見老年SHR足細胞足突明顯融合脫失，可知高血壓衰老時腎小球足細胞發(fā)生損傷。高血壓衰老時腎皮質AngⅡ水平明顯降低，腎小球AT1R蛋白表達明顯增多，AT2R蛋白表達明顯下降，足細胞自噬活性增高，推測高血壓衰老時，AngⅡ通過表達增多的AT1R持續(xù)刺激足細胞，誘導足細胞自噬活性保持在高水平或是過度增強，自噬降解包括nephrin在內的足細胞大分子結構蛋白過多，

13、此類蛋白清除多于合成，足細胞就會發(fā)生損傷，這可能是高血壓衰老時腎損傷的機制之一。
　　(4)ACEI/ARB干預后，與CTEL組相比，ARB組、Combined組尿蛋白/尿肌酐比值明顯降低，且ACEI組、ARB組、Combined組腎小球nephrin蛋白表達水平明顯升高，光鏡和電鏡觀察4組SHR中以Combined組腎臟病變較輕，提示ACEI/ARB對腎臟具有保護作用。
　　(5)ACEI/ARB干預后，電鏡所見ACEI組

14、、ARB組、Combined組腎小球足細胞自噬體均增多，其中Combined組的明顯多于CTRL組，結合western blot結果，提示ACEI/ARB干預后老年SHR腎小球足細胞白噬體有所堆積，自噬活性減弱。
　　(6)結合本實驗所見，得出以下推測;老年SHR腎小球足細胞自噬活性過度增強，包括nephrin在內的足細胞結構蛋白被過度降解而導致足細胞損傷，甚至是足細胞死亡，促進了高血壓腎損傷的發(fā)生及發(fā)展;ACEI/ARB干預后，