微小RNA145靶向抑制HIF-2α表達對神經(jīng)母細胞瘤增殖、凋亡及血管生成的影響.pdf

1、第一部分miR-145在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及其真核表達載體的構(gòu)建
　　目的：研究miR-145在神經(jīng)母細胞瘤臨床標本中的表達,構(gòu)建miR-145表達載體。
　　方法：收集5例神經(jīng)母細胞瘤患者手術(shù)組織標本,通過real-timePCR檢測在神經(jīng)母細胞瘤組織中miR-145的表達情況。根據(jù)人pre-miR-145序列,合成兩條互補的寡核苷酸鏈,退火后連接入含有殺稻瘟菌素抗性pPG-miR-EGFP載體,進行轉(zhuǎn)化細菌擴增后進行測

2、序鑒定。
　　結(jié)果：通過real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn),與正常背根神經(jīng)節(jié)組織相比,在5例神經(jīng)母細胞瘤組織樣本中miR-145表達水平均下調(diào),平均下降67％(P﹤0.05)。質(zhì)粒測序顯示序列正確,將質(zhì)粒命名為pPG-miR145-EGFP。
　　結(jié)論：神經(jīng)母細胞瘤組織中,miR-145的表達水平與正常背根神經(jīng)節(jié)相比顯著減少,提示miR-145的表達下調(diào)可能與神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)病機制有關(guān)。成功構(gòu)建pPG-miR-145-EGFP

3、干擾質(zhì)粒。
　　第二部分miRNA-145對神經(jīng)母細胞瘤增殖凋亡和血管生成的調(diào)控作用
　　目的：建立miR-145穩(wěn)定表達細胞株,研究miR-145在神經(jīng)母細胞瘤增值、凋亡和血管生成中的作用。
　　方法：將構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒和空白質(zhì)粒在陽性脂質(zhì)體Lipofectamine2000的介導下分別轉(zhuǎn)神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-MC和SK-N-SH,48h后加入殺稻瘟菌素(200μg/ml),持續(xù)篩選兩個月。經(jīng)real-time

4、PCR和熒光顯微鏡鑒定獲得穩(wěn)定表達miR-145細胞株。將化學合成的miR-145mimics分別轉(zhuǎn)染至SK-N-MC和SK-N-SH中,48h后分別采用MTT、流式細胞術(shù)(PI單標)、Edu染色和裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測miRNA-145對神經(jīng)母細胞瘤增殖的影響,采用小管形成實驗檢測miR-145過表達對血管生成的作用,采用流式細胞術(shù)(PI-AnnexineV雙標)檢測miR-145對神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：穩(wěn)轉(zhuǎn)SK

5、-N-MC和SK-N-SH細胞綠色熒光蛋白表達率占所有細胞總數(shù)70%以上,real-timePCR檢測miR-145表達質(zhì)粒組miR-145表達水平分別為空白對照組的4.2倍和2.6倍。轉(zhuǎn)染miR-145后,神經(jīng)母細胞瘤細胞S期減少,增殖減弱,細胞凋亡增加。裸鼠成瘤實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-145的神經(jīng)母細胞瘤細胞致瘤性降低。miR-145干擾組較對照組血管生成能力下降。
　　結(jié)論：成功建立穩(wěn)轉(zhuǎn)的神經(jīng)母細胞瘤細胞株,miRNA-145

6、明顯抑制神經(jīng)母細胞瘤的增殖,促使凋亡增加并抑制血管生成。
　　第三部分miRNA-145調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤增殖、凋亡和血管生成的機制研究
　　目的：探討miR-145抑制神經(jīng)母細胞瘤增殖和血管生成并促進其凋亡的分子機制。
　　方法：將化學合成的miR-145mimics轉(zhuǎn)入SK-N-MC和SK-N-SH細胞48h后,運用Microarray基因表達芯片檢測瘤細胞基因表達差異。通過real-timePCR和westernb

7、lot檢測高表達miR-145神經(jīng)母細胞瘤細胞中HIF-2αmRNA和蛋白表達水平變化。轉(zhuǎn)染靶向HIF-2α的小干擾RNA(siRNA),采用MTT比色分析、雙標流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)母細胞瘤增殖活性、細胞凋亡;采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-145對靶基因HIF-2α3'-UTR的調(diào)控作用;采用小管形成實驗檢測轉(zhuǎn)染沉默HIF-2α前后,瘤細胞血管生成能力的變化。
　　結(jié)果：全基因組掃描芯片、real-timePCR和weste