單核-巨噬細(xì)胞在肝衰竭中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 肝衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重而廣泛的肝細(xì)胞死亡，導(dǎo)致肝臟本身合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機(jī)制障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床證候群。肝衰竭內(nèi)科綜合治療效果不佳，預(yù)后差，病死率高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，影響社會(huì)穩(wěn)定。肝衰竭的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已成為肝病學(xué)的研究熱點(diǎn)。在肝衰竭發(fā)生和發(fā)展過程中，天然免疫系統(tǒng)的單核/巨噬細(xì)胞起了重要作用。巨噬細(xì)胞在各免疫細(xì)胞中的比例

2、、免疫功能狀態(tài)以及釋放炎癥因子的類型決定著肝臟局部炎癥狀態(tài)，最終影響肝衰竭的臨床特點(diǎn)和結(jié)局。若能深入研究肝衰竭進(jìn)程中肝臟巨噬細(xì)胞的表型及功能改變，早期抑制巨噬細(xì)胞的過度活化，阻止炎癥重癥化，便有可能從源頭上遏制肝衰竭的發(fā)生。目前有關(guān)肝衰竭時(shí)單核/巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)的演變規(guī)律以及調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚，為此本課題旨在研究單核/巨噬細(xì)胞在肝衰竭進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)表型及功能變化、探討免疫分子高遷移率族蛋白1（high mobility group box

3、protein1，HMGB1）對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞的炎癥免疫調(diào)控作用、揭示調(diào)節(jié)肝臟巨噬細(xì)胞功能的分子靶標(biāo)及相關(guān)信號(hào)通路，為肝衰竭早期診斷、預(yù)防和治療提供新的思路。
　　 研究方法:
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 經(jīng)小鼠尾靜脈注射ConA（20 mg/kg）制備小鼠急性肝衰竭模型，并于注射后1、3、6、12、24小時(shí)處死動(dòng)物，收集肝組織和外周血，對(duì)肝組織進(jìn)行蘇木素-伊紅染色觀察肝組織病理學(xué)改變，同時(shí)進(jìn)行肝功能（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移

4、酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）檢測(cè)。分離1、3、6小時(shí)組以及正常對(duì)照組的外周血單個(gè)核細(xì)胞和肝臟巨噬細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Ly6C+CD11b+單核細(xì)胞和肝臟F4/80+巨噬細(xì)胞的表達(dá)頻率，熒光定量PCR檢測(cè)肝臟巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6及HMGB1mRNA的表達(dá)水平，Annexin V和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)肝臟巨噬細(xì)胞的凋亡情況，Western blot試驗(yàn)和免疫熒光激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)肝組織及肝臟巨噬細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)

5、及轉(zhuǎn)位，同時(shí)用ELISA方法檢測(cè)血清HMGB1水平。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)
　　 原代分離、培養(yǎng)和鑒定正常小鼠來(lái)源的肝臟巨噬細(xì)胞，用HMGB1-siRNA干擾細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)，給予ConA5μg/ml體外誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MHCⅡ的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α及IL-6水平，同時(shí)用Western blot檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白（ERK和p38 MAPK）的磷酸化水平。
　　

6、 3.臨床研究
　　 采自63例慢性輕/中度乙型肝炎、39例慢加急性肝衰竭（早期）、27例HBV攜帶者及18例健康對(duì)照者的血清，病例組和對(duì)照組在年齡、性別方面均無(wú)顯著生差異(P＞0.05），用ELISA方法檢測(cè)HBV血清標(biāo)記物和血清HMGB1水平，同時(shí)檢測(cè)血清病毒學(xué)指標(biāo)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素和凝血酶原活動(dòng)度，并分析血清HMGB1與各肝功能指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.

7、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)肝衰竭進(jìn)程中，外周血炎癥性Ly6C+CD11b+單核細(xì)胞亞群在總CD11b+單核細(xì)胞中的比例逐漸增高。
　　 (2)肝臟巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR4和MHCⅡ的水平以及TNF-α和IL-6 mRNA水平在肝衰竭早期明顯增高，后期呈減少趨勢(shì)。
　　 (3)肝衰竭進(jìn)程中，肝臟巨噬細(xì)胞在肝臟單個(gè)核細(xì)胞中的比例逐漸減少，同時(shí)細(xì)胞的凋亡率增加。
　　 (4)血清及肝組織HMGB1的水平隨著疾病進(jìn)展

8、而明顯增加，呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng)。
　　 (5)肝臟巨噬細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)在肝衰竭早期明顯增高，部分HMGB1蛋白從胞核轉(zhuǎn)移至胞漿，后期可釋放至細(xì)胞外，而且表達(dá)呈減少趨勢(shì)。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)經(jīng)HMGBI-siRNA干擾后，受Con A刺激的肝臟巨噬細(xì)胞中MHCⅡ的表達(dá)水平仍升高，與對(duì)照-siRNA組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　 (2)經(jīng)HMGB1-siRNA干擾后，受ConA

9、刺激的肝臟巨噬細(xì)胞釋放TNF-α及IL-6減少，與對(duì)照-siRNA組比較有明顯差異（P＜0.05）。
　　 (3) Con A刺激后，肝臟巨噬細(xì)胞中ERK and p38 MAPK蛋白的磷酸化水平升高，經(jīng)HMGB1-siRNA干擾后，可以顯著減輕以上兩個(gè)信號(hào)蛋白的磷酸化水平，與對(duì)照-siRNA組比較有明顯差異（P＜0.05）。
　　 3.臨床研究結(jié)果
　　 (1)輕/中度乙型肝炎和慢加急性肝衰竭（早期）患者血清中

10、HMGB1的水平明顯高于HBV攜帶者及健康對(duì)照者（P＜0.05），輕/中度乙型肝炎組和慢加急性肝衰竭（早期）組之間也有明顯差異（P＜0.05）。
　　 (2)慢性乙型肝炎患者血清HMGB1水平與ALT/AST水平及血清總膽紅素水平成正相關(guān)性（P＜0.05），與凝血酶原活動(dòng)度成負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。
　　 研究結(jié)論:
　　 (1)肝臟巨噬細(xì)胞在Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭的不同階段表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài):早期，