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文檔簡(jiǎn)介
1、研究目的與內(nèi)容:
本研究旨在探究CD24分子在刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的模型中對(duì)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其可能的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)包括以下三個(gè)方面:
一、建立Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型,觀察CD24分子在小鼠急性肝損傷中的作用。二、檢測(cè)CD24分子在肝臟固有免疫細(xì)胞的表達(dá),觀察CD24分子對(duì)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。三、分析急性肝損傷過(guò)程中肝臟巨噬細(xì)胞的來(lái)源及功能變化
2、,探究CD24分子調(diào)節(jié)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制。
研究方法和結(jié)果:
本課題實(shí)驗(yàn)共分三部分進(jìn)行:
第一部分觀察CD24分子對(duì)Con A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的作用,包括以下三個(gè)實(shí)驗(yàn):
1.分別以不同濃度和時(shí)間點(diǎn)的Con A刺激小鼠,觀察小鼠解剖學(xué)上的改變, H&E染色觀察小鼠肝臟損傷程度,血清學(xué)方法檢測(cè)小鼠肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的變化,建立Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型。
結(jié)果表
3、明:Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有時(shí)間和劑量依賴性,當(dāng)尾靜脈注射10mg/kg小鼠9h后,小鼠肝組織腫大,肝臟充血嚴(yán)重,且血清的ALT水平顯著升高。
2.觀察anti-CD24中和抗體(200μg/mouse)和10mg/kg Con A聯(lián)合注射組小鼠肝臟解剖學(xué)上的改變;H&E染色觀察小鼠肝組織病理改變;血清學(xué)方法檢測(cè)小鼠肝功能指標(biāo)ALT水平的變化。
結(jié)果表明:anti-CD24中和抗體導(dǎo)致小鼠的肝組織腫大;且出現(xiàn)
4、明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死;小鼠的血清ALT水平顯著升高。
3.觀察CD24-/-基因敲除小鼠注射Con A后肝臟解剖學(xué)上的改變;H&E染色觀察小鼠肝組織病理改變;血清學(xué)方法檢測(cè)小鼠肝功能指標(biāo)ALT水平的變化。
結(jié)果表明:CD24-/-基因敲除的小鼠炎癥反應(yīng)顯著高于WT小鼠,且出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死,小鼠的血清ALT水平顯著升高。
第二部分觀察 CD24分子對(duì)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,包括
5、以下三個(gè)實(shí)驗(yàn):
1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝損傷后 CD24分子的表達(dá)變化及其在肝內(nèi)不同免疫細(xì)胞的表達(dá)量。
結(jié)果表明:Con A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷后,小鼠肝組織細(xì)胞CD24分子表達(dá)顯著降低。在肝臟天然免疫細(xì)胞中,CD24分子在肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的表達(dá)量最高。
2.注射氯氟松(Clophosome)消耗小鼠肝臟巨噬細(xì)胞,觀察小鼠肝損傷后解剖學(xué)上的改變,H&E染色觀察小鼠肝臟損傷程度,血清學(xué)方法檢測(cè)小鼠ALT水平的變化。
6、
結(jié)果表明:氯氟松消耗小鼠肝臟巨噬細(xì)胞后,小鼠的炎癥反應(yīng)顯著下降,肝臟充血減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,無(wú)壞死出現(xiàn),血清ALT水平顯著下降。且小鼠的M1型和M2型巨噬細(xì)胞均顯著下降。
3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Con A刺激小鼠急性肝損傷后肝內(nèi)巨噬細(xì)胞亞型的改變,Anti-CD24中和抗體對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞亞型分布的影響。檢測(cè)CD24-/-基因敲除小鼠和 WT小鼠急性肝損傷后巨噬細(xì)胞亞型分布的改變。檢測(cè)注射氯氟松消耗小鼠巨噬
7、細(xì)胞后,巨噬細(xì)胞亞型的改變。
結(jié)果表明:Con A刺激3h-9h,M1型巨噬細(xì)胞的頻率顯著增加。Anti-CD24中和抗體顯著增加 M1型巨噬細(xì)胞的頻率,而 M2型巨噬細(xì)胞的頻率變化不明顯。CD24-/-基因敲除小鼠的M1型巨噬細(xì)胞的頻率顯著高于WT小鼠,M2型巨噬細(xì)胞變化不明顯。注射氯氟松后,小鼠的M1型和M2型巨噬細(xì)胞均顯著下降,且CD24-/-基因敲除小鼠的M1型巨噬細(xì)胞比例高于WT鼠。
第三部分探究 CD24
8、分子調(diào)節(jié)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制,包括以下三個(gè)實(shí)驗(yàn):
1.Real time PCR檢測(cè)不同組小鼠肝臟組織和細(xì)胞水平M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞的來(lái)源和增殖方式。
結(jié)果表明:注射Con A后,小鼠肝臟組織水平和體外刺激巨噬細(xì)胞水平M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的 mRNA表達(dá)均顯著上升,M1型巨噬細(xì)胞主要為單核細(xì)胞來(lái)源,也有極小部分通過(guò)肝內(nèi)的自我更新來(lái)實(shí)現(xiàn)。
2. Realtim
9、e PCR檢測(cè)不同基因背景小鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12等炎癥因子及CCR1、CCR2、CCR5等趨化因子mRNA的表達(dá)情況。
結(jié)果表明:Con A刺激后,CD24-/-基因敲除小鼠肝臟的炎癥因子mRNA表達(dá)均顯著高于WT小鼠。CCR2趨化因子mRNA表達(dá)顯著高于WT小鼠。
3. Real time PCR檢測(cè)注射氯氟松后,肝臟組織表達(dá)腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis
10、factor-α,TNF-α)的變化,肝臟巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α的變化。胞內(nèi)染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組小鼠肝臟M1型巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的凋亡率。
結(jié)果表明:注射氯氟松后,小鼠肝臟組織的TNF-α mRNA表達(dá)顯著下降。Anti-CD24中和抗體和CD24-/-基因敲除小鼠的M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞分泌的TNF-α均顯著高于WT對(duì)照組小鼠。聯(lián)合刺激組小鼠和CD24-/-基因敲除小鼠的肝細(xì)胞
11、早期和晚期凋亡率均顯著高于WT對(duì)照組小鼠。
結(jié)論:
1. Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有時(shí)間和劑量依賴性,CD24分子可以保護(hù)Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。
2. CD24分子對(duì)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞亞型具有調(diào)節(jié)作用,通過(guò)抑制M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)來(lái)保護(hù)Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。
3.肝內(nèi)M1亞型巨噬細(xì)胞主要來(lái)源于單核細(xì)胞,極少量來(lái)源于肝內(nèi)的自我增殖和更新,CD24分子可以降低單核細(xì)胞來(lái)源的M1型
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