衣原體分泌糖脂對(duì)iNKT細(xì)胞的激活作用及Il-22在衣原體感染中的作用研究.pdf

1、第一部分沙眼衣原體分泌性糖脂(GLXA)對(duì)iNKT細(xì)胞激活作用的研究
　　 研究目的：
　　 衣原體（Chlamydiae）是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生，有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物，衣原體感染與許多人類疾病有著密切聯(lián)系。根據(jù)基因型的不同，衣原體可分為沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)和肺炎衣原體（Chlamydiapneumoniae，Cpn）兩個(gè)種屬。其中沙眼衣原體主要引起呼吸道感染、眼部粘膜感

2、染及性傳播疾病。最近，沙眼衣原體中的鼠類變種株被單獨(dú)劃分出來(lái)，被命名為衣原體鼠肺炎株（Chlamydiamuridarum，Cm），該株廣泛用于建立小鼠肺部或生殖道感染模型，進(jìn)行沙眼衣原體致病機(jī)制的理論研究。而肺炎衣原體主要引起支氣管炎、鼻竇炎、肺炎等呼吸道疾病。雖然抗生素可有效控制衣原體的感染癥狀，但是衣原體感染的臨床表現(xiàn)具有多樣性，大多數(shù)以隱性感染的形式存在，被感染者不能及時(shí)就診，使得抗生素對(duì)感染的控制力大大減弱，因此，研發(fā)安全有效

3、的疫苗對(duì)控制衣原體感染意義重大，目前尚無(wú)有效的疫苗預(yù)防和（或）治療衣原體感染。闡明衣原體感染過(guò)程中免疫保護(hù)和免疫病理的機(jī)制是合理研制安全有效衣原體疫苗的首要條件。
　　 自然殺傷性T細(xì)胞（invariantnaturalkillerTcell，iNKT）作為獨(dú)特的T細(xì)胞亞群識(shí)別由非經(jīng)典的MHCI類分子CD1d遞呈的糖脂類抗原，而不是肽類抗原。研究表明，在衣原體感染中iNKT細(xì)胞被激活并產(chǎn)生細(xì)胞因子，通過(guò)其對(duì)獲得性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)在

4、衣原體感染的進(jìn)程和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。衣原體分泌性糖脂抗原(glycolipidexoantigen，GLXA)是目前已被報(bào)道的一種和衣原體感染相關(guān)的糖脂抗原，但GLXA能否活化NKT細(xì)胞，以及它是否是衣原體感染中對(duì)iNKT細(xì)胞作用的關(guān)鍵抗原尚不清楚。因此，本研究擬證實(shí)GLXA能否在體內(nèi)外激活iNKT細(xì)胞，進(jìn)一步明確衣原體感染的免疫機(jī)制，為以GLXA為靶點(diǎn)的衣原體疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 提取衣原

5、體培養(yǎng)上清中的分泌性糖脂，并以相同的方法提取未感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的脂類(cellmock)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，對(duì)糖脂成分進(jìn)行銀染顯色和WesternBlot鑒定分析。為驗(yàn)證該糖脂是否能夠激活iNKT細(xì)胞，采用了體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)分別進(jìn)行驗(yàn)證:
　　 1.體外實(shí)驗(yàn):
　　 1)CD1d蛋白+NKT雜交瘤共培養(yǎng)系統(tǒng):用CD1d融合蛋白包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后在板中加入GLXA和NKT雜交瘤進(jìn)行共培養(yǎng)，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL

6、-2的水平，以明確GLXA能否活化NKT雜交瘤細(xì)胞。
　　 2)體外共培養(yǎng)系統(tǒng):制備小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(DC)，經(jīng)糖脂沖擊樹突狀細(xì)胞24小時(shí)后，與肝臟單個(gè)核細(xì)胞(LMC)共培養(yǎng)，48小時(shí)后收集培養(yǎng)上清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4。并在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中采用iNKT缺陷小鼠以及CD1d抗體封閉系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證作用機(jī)制。
　　 2.體內(nèi)試驗(yàn):
　　 1)靜脈注射:采用C57BL/6(WT)小鼠和iNKT

7、缺陷小鼠，分別經(jīng)尾靜脈注射給予GLXA，注射后2h對(duì)小鼠取血，用ELISA檢測(cè)血清中IL-4的表達(dá)水平，注射后12h取血，用ELISA檢測(cè)血清中IFN-γ的表達(dá)水平。
　　 2)腹腔注射:小鼠腹腔注射GLXA，用流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)iNKT表面活化標(biāo)志及細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.糖脂鑒定:銀染顯色和WesternBlot分析顯示，提取的衣原體分泌性糖脂與文獻(xiàn)報(bào)道的GLXA條帶一致，與cell

8、mock實(shí)驗(yàn)對(duì)照組形成的條帶明顯不同。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn):
　　 1)CD1d蛋白+NKT雜交瘤共培養(yǎng)系統(tǒng):與對(duì)照組相比，GLXA可特異性活化NKT雜交瘤細(xì)胞，使其產(chǎn)生IL-2。
　　 2)體外共培養(yǎng)系統(tǒng):GLXA沖擊組產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4均高于cellmock沖擊組及陰性對(duì)照組（DC未經(jīng)抗原刺激），表明分泌性糖脂能夠激活LMC產(chǎn)生細(xì)胞因子。為進(jìn)一步驗(yàn)證LMC產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4主要來(lái)源于iNKT細(xì)

9、胞，在DC-LMC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中采用了iNKT缺陷小鼠以及CD1d抗體封閉，結(jié)果顯示:(1)來(lái)源于iNKT缺陷小鼠LMC產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4均顯著低于野生型小鼠.(2)加入CD1d抗體封閉后，野生型小鼠LMC產(chǎn)生IFN-γ和IL-4也明顯下降。由此證明衣原體分泌性糖脂誘導(dǎo)的細(xì)胞因子主要由iNKT細(xì)胞產(chǎn)生，而且此作用部分依賴于CD1d分子。
　　 3.體內(nèi)試驗(yàn):
　　 1)靜脈注射:在給予GLXA刺激的野生型小鼠血清中

10、，可檢測(cè)出較高水平的IFN-γ和IL-4，在iNKT缺陷小鼠中卻沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，說(shuō)明血清中較高水平的IFN-γ和IL-4主要是由iNKT細(xì)胞產(chǎn)生的，而且是GLXA促進(jìn)iNKT細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
　　 2)腹腔注射:通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，與對(duì)照組相比GLXA可明顯提高iNKT細(xì)胞表面活化標(biāo)志的表達(dá)，并促進(jìn)其分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4，說(shuō)明其對(duì)iNKT細(xì)胞有明顯的激活作用。
　　 研究結(jié)論：
　　 以上實(shí)驗(yàn)證

11、明，衣原體分泌性糖脂GLXA能夠激活iNKT細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞因子，并且該活化作用在一定程度上依賴CD1d分子的遞呈作用，GLXA可能是衣原體感染中iNKT細(xì)胞活化的關(guān)鍵抗原，有關(guān)GLXA激活iNKT細(xì)胞的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　 研究意義：
　　 該研究進(jìn)一步完善了我們對(duì)衣原體致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，加深了衣原體感染引起的宿主免疫反應(yīng)機(jī)制的了解，為以GLXA為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)疫苗抵抗衣原體感染奠定了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　 第

12、二部分、白細(xì)胞介素-22在衣原體肺部感染中的生物學(xué)作用
　　 研究目的：
　　 白細(xì)胞介素-22(IL-22)是IL-10細(xì)胞因子家族的一員，它是一種炎癥因子，在調(diào)控組織局部免疫方面起著重要的作用。近期的研究證實(shí)，IL-22在抵抗細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲感染所引發(fā)的宿主免疫中起到一定保護(hù)作用。目前普遍接受的觀點(diǎn)是IL-22在枸櫞酸桿菌、克雷伯桿菌、分節(jié)絲狀桿菌等胞外菌引起的感染中起到保護(hù)作用，但是IL-22在宿主抵抗胞內(nèi)

13、菌感染中的作用目前仍不明確。因此進(jìn)一步在胞內(nèi)菌感染模型中評(píng)估IL-22的作用是十分必要的，這有利于明確IL-22在胞內(nèi)菌感染中的生物學(xué)效應(yīng)，并為其提供更充分的理論學(xué)依據(jù)。
　　 衣原體是專性胞內(nèi)寄生菌，其中對(duì)人類致病的種屬是沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)和肺炎衣原體（Chlamydiapneumonia，Cpn）。沙眼衣原體主要引起呼吸道、眼睛及性疾病的傳播。肺炎衣原體主要引起支氣管炎、鼻竇炎和肺炎

14、。由于衣原體菌株具有一定的種屬特異性，近些年引起小鼠肺炎的菌株被單獨(dú)劃分出來(lái)稱為鼠肺炎衣原體（Chlamydiamuridarum，Cm）。目前在實(shí)驗(yàn)研究中，鼠肺炎衣原體株被廣泛用于小鼠呼吸道和生殖道感染模型中。在小鼠呼吸道感染模型中，目前的研究證實(shí)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)起到主要的保護(hù)作用，可有效控制衣原體感染，對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸起到?jīng)Q定性作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Th17在宿主防御衣原體感染中也起到重要的作用，它可以促進(jìn)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)

15、。因此，Th1和Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)于宿主清除病原菌起到重要的促進(jìn)作用。IL-22和IL-17是Th17細(xì)胞亞群主要產(chǎn)生的細(xì)胞因子，它們?cè)谠S多感染模型中都起到相互協(xié)同的作用。迄今為止，沒有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)IL-22在小鼠肺部衣原體感染中的作用。在本研究中，我們擬用抗小鼠IL-22單克隆抗體封閉小鼠體內(nèi)固有產(chǎn)生的IL-22，從而進(jìn)一步評(píng)估IL-22在小鼠肺部衣原體感染中的作用。
　　 研究方法：
　　 1、IL-22抗體封閉

16、實(shí)驗(yàn):在小鼠Cm肺感染模型中，用小鼠IL-22單克隆抗體對(duì)肺局部的IL-22進(jìn)行封閉，以檢測(cè)IL-22的作用。
　　 1)流式細(xì)胞術(shù):檢測(cè)Th1、Th17、Treg等細(xì)胞亞群的變化情況。
　　 2)ELISA:檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-17、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
　　 3)RT-PCR:檢測(cè)IL-22、IL-17、IFN-γ、T-bet、RORγt在RNA水平上的

17、變化情況。
　　 4)HE染色:肺組織切片鏡檢。
　　 2、IL-22蛋白給予實(shí)驗(yàn):在小鼠Cm肺感染模型中，肺局部給予小鼠純化IL-22蛋白，以檢測(cè)IL-22對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的影響。
　　 1)流式細(xì)胞術(shù):檢測(cè)Th1、Th17等細(xì)胞亞群的變化情況。
　　 2)ELISA:檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
　　 3)HE染色:肺組織切片鏡檢。
　　 研究結(jié)果：
　　

18、 1、IL-22抗體封閉實(shí)驗(yàn):IL-22在小鼠Cm肺部感染的早期階段就有升高表達(dá)，用抗體將其封閉后結(jié)果如下:與同型對(duì)照組相比，IL-22抗體封閉組的肺部炎癥更加嚴(yán)重，表現(xiàn)為體重下降更明顯，負(fù)菌量升高，病理組織切片炎癥浸潤(rùn)更加明顯。流式分析顯示IL-22抗體封閉組的Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)降低，而CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群增高，此外IL-10的生成也隨著IL-22的封閉而減少。
　　 2、IL-22蛋白

19、給予實(shí)驗(yàn):將IL-22純化蛋白給予Cm肺部感染的小鼠后，很好地控制了肺部炎癥的發(fā)展和衣原體的增殖，并促進(jìn)了肺部的Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　 研究結(jié)論：
　　 IL-22產(chǎn)生并高表達(dá)于小鼠Cm肺部感染的早期階段，可以保護(hù)機(jī)體減輕衣原體的肺部感染。IL-22這種保護(hù)性作用主要是通過(guò)促進(jìn)Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。
　　 研究意義
　　 IL-22作為一種重要的炎癥因子參與了機(jī)體防御衣原體肺部感染的進(jìn)程，它對(duì)