發(fā)育期DEHP暴露通過干擾大腦甲狀腺激素誘導(dǎo)小鼠海馬突觸發(fā)育損害的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters, PAEs）作為增塑劑被廣泛應(yīng)用于食品包裝袋、兒童玩具、醫(yī)療器材、化妝品等產(chǎn)品中，由于PAEs與其他基質(zhì)分子間為非共價(jià)結(jié)合，易于從產(chǎn)品中逸出，遷移至周邊環(huán)境中，人群暴露狀況嚴(yán)峻。PAEs具有抗雄激素和微弱的擬雌激素作用，可引起生殖與發(fā)育毒性，是公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。近年發(fā)現(xiàn) PAEs對甲狀腺激素亦具有干擾作用。PAEs中以鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[di(2-eth

2、ylexyl) phthalate, DEHP]應(yīng)用最為廣泛，DEHP能夠通過胎盤屏障和血腦屏障，因此其神經(jīng)發(fā)育毒性備受關(guān)注。已有相關(guān)研究證實(shí)，DEHP的性激素干擾特性可能在其所致神經(jīng)發(fā)育損傷中發(fā)揮作用。然而，從甲狀腺內(nèi)分泌干擾方面探討DEHP神經(jīng)毒性機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。
　　研究目的：探討DEHP甲狀腺激素干擾特性在其所致突觸發(fā)育損害中的作用，為探討DEHP神經(jīng)毒性機(jī)制提供新思路。
　　研究方法：取自然分娩ICR小鼠，共

3、14窩，每窩于出生后4天調(diào)整為5只雄鼠，同窩仔鼠隨機(jī)分為空白對照組、溶劑對照組以及 DEHP處理組（10、50、200mg/kg·d），每組14只?？瞻讓φ战M給予超純水，溶劑對照組給予含1%Tween80與1%玉米油的乳濁液，DEHP處理組給予按前述溶劑配置的DEHP乳濁液。出生后5天開始按20μL/g體重對仔鼠進(jìn)行灌胃給藥，每日1次，至出生后38天。期間每天稱量并記錄小鼠體重，出生后21天離乳后稱量各組小鼠每日平均飼料消耗量及飲水量。

4、出生后26天進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，評估小鼠自發(fā)性探索活性及焦慮狀態(tài)；出生后30天開始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，前5d進(jìn)行定位航行測試，間隔2d，第8d進(jìn)行空間探索測試，評估小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束48h后，應(yīng)用10%水合氯醛溶液按0.04mL/10g體重進(jìn)行腹腔注射麻醉，采用摘眼球取血，分離血清，應(yīng)用直接化學(xué)發(fā)光法于全自動(dòng)生化分析儀上測定血清甲狀腺激素（T3、T4、FT3、FT4）及TSH水平；取雙側(cè)睪丸組織并稱重；經(jīng)心臟行生理

5、鹽水灌注后斷頭，取小腦組織，應(yīng)用LC-MS檢測DEHP主要一級代謝產(chǎn)物MEHP濃度；取單側(cè)大腦半球，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法檢測腦組織T3與T4水平；分離單側(cè)大腦海馬組織，應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein95，PSD95）、突觸素I（synapsin I）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、甲狀腺激素受體α1（th

6、yroid hormone receptorα1，TRα1）、甲狀腺激素受體β1（thyroid hormone receptorβ1，TRβ1）、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體8（monocarboxylate transporter8，MCT8）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1C1（organic anion transporting polypeptide1C1，OATP1C1）、II型脫碘酶（deiodinase II，DIO2）、III型脫碘酶（deio

7、dinase III，DIO3）蛋白水平。
　　結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)在溶劑對照組與空白對照組之間均無明顯差異（皆 P＞0.05）。200mg/kg·d DEHP組小鼠體重增加減少、睪丸臟器系數(shù)下降、小腦組織中 MEHP水平升高（與溶劑對照組比較，皆P＜0.05），表明DEHP可能引起了明顯的抗雄激素效應(yīng)，且能通過血腦屏障。各組小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)空間探索階段中總運(yùn)動(dòng)距離均無明顯差異（皆P＞0.05），表明本次研究劑量范圍DEHP未明

8、顯影響小鼠運(yùn)動(dòng)能力。曠場實(shí)驗(yàn)中，200mg/kg?d DEHP組小鼠曠場中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少（與溶劑對照組比較，P＜0.05），而10與50mg/kg·d DEHP組小鼠與溶劑對照組比較無明顯差異（P＞0.05），表明10與50mg/kg·d DEHP未明顯引起小鼠焦慮情緒。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，200mg/kg·d DEHP組小鼠登臺潛伏期延長（與溶劑對照組比較，P＜0.05）；空間探索階段，50mg/kg·d DEHP組小鼠目標(biāo)象

9、限運(yùn)動(dòng)距離及時(shí)間減少（與溶劑對照組比較，P＜0.05），表明50mg/kg·d DEHP能夠損傷小鼠空間記憶能力。DEHP各劑量組小鼠海馬PSD95蛋白水平均降低（與溶劑對照組比較，皆P＜0.05），200mg/kg·d DEHP組還觀察到小鼠海馬synapsin I蛋白水平降低（與溶劑對照組比較，P＜0.05），表明 DEHP可損害小鼠突觸發(fā)育。各組血清T3、T4、FT3、FT4、TSH水平及腦組織T3、T4水平均無明顯差異（皆P＞0

10、.05），而200mg/kg·d DEHP組小鼠腦組織T4/T3比值明顯升高（與溶劑對照組比較，P＜0.05），表明 DEHP雖然未影響循環(huán)中甲狀腺素穩(wěn)態(tài)，但高劑量可引起大腦 T4和T3的相對平衡。DEHP各劑量組小鼠海馬OATP1C1蛋白水平均降低（與溶劑對照組比較，皆P＜0.05），10mg/kg?d DEHP組還觀察到海馬MCT8蛋白水平降低（與溶劑對照組比較，P＜0.05），各組小鼠海馬DIO2與DIO3蛋白水平均無明顯差異（皆

11、P＞0.05），提示 DEHP可能會(huì)影響海馬甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)。海馬甲狀腺素受體的檢測發(fā)現(xiàn)，200mg/kg·d DEHP組的TRα1和TRβ1蛋白水平均降低（與溶劑對照組比較，皆P＜0.05），需要特別注意的是，50mg/kg·d DEHP組TRβ1蛋白水平就開始降低（與溶劑對照組比較，P＜0.05），提示在受體水平，DEHP可能首先影響TRβ1。200mg/kg·d DEHP組小鼠海馬BDNF蛋白水平降低（與溶劑對照組比較，P＜0.05

12、）。
　　結(jié)論：⑴發(fā)育期暴露較高劑量DEHP（200mg/kg·d）能夠影響小鼠一般發(fā)育，可能引起了明顯的抗雄激素效應(yīng)，能夠損害海馬突觸發(fā)育，引起焦慮情緒并降低空間學(xué)習(xí)能力，能夠引起大腦甲狀腺激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，并可能干擾了甲狀腺激素受體信號；
　?、瓢l(fā)育期暴露較低劑量DEHP（50mg/kg·d）雖然未明顯影響小鼠一般發(fā)育、未引起明顯的焦慮情緒，但能夠損害小鼠海馬突觸發(fā)育，降低空間記憶能力，可能干擾了海馬局部甲狀腺激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)及