AT1-R在雌激素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的健康。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，高水平雌激素長期刺激與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病關(guān)系密切，AT1-R子宮內(nèi)膜癌中存在過表達(dá)，為此探討AT1-R在雌激素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A增殖、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化中的作用及其對ERK1/2表達(dá)的影響。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光技術(shù)檢測AT1-R在HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)；脂質(zhì)體介導(dǎo)AT1-R-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A，

2、經(jīng)G418選擇培養(yǎng)，采用Westernblot檢測轉(zhuǎn)染前后HEC-1A細(xì)胞中AT1-R蛋白的表達(dá)。MTT法檢測無雌激素誘導(dǎo)及雌激素誘導(dǎo)10min轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期；Western blot檢測ERK1/2蛋白及ER蛋白表達(dá)水平。
　　 材料和方法:
　　 一、材料
　　 1、細(xì)胞系 ER低表達(dá)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。
　　 2、試劑水溶性1

3、7β-雌二醇、四甲基亞唑藍(lán)(MTT)和碘化丙啶購自美國Sigma公司，AT1-R-siRNA由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成并進(jìn)行熒光標(biāo)記(AT1-RsiRNA正義鏈：5′GTATGCCTTCCTGTTTAAA3′)，LipofectamineTM2000購自invitrogen公司，G418購自德國merck公司。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 免疫熒光技術(shù)檢測AT1-R在HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)；脂質(zhì)體介導(dǎo)AT1-R-

4、siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)，采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后HEC-1A細(xì)胞中AT1-R蛋白的表達(dá)。MTT法檢測無雌激素誘導(dǎo)及雌激素誘導(dǎo)10min轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期；Western blot檢測ERK1/2蛋白及ER蛋白表達(dá)水平。
　　 三、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，P＜

5、0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)AT1-R表達(dá)于HEC-1A細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。
　　 2、轉(zhuǎn)染AT1-R-siRNA-GFP48h后在熒光顯微鏡下觀察，可見部分細(xì)胞呈綠色熒光，表示siRNA已成功轉(zhuǎn)染入HEC-1A細(xì)胞。經(jīng)G418篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代兩個月，獲得穩(wěn)定的細(xì)胞克隆HEC-1A-siRNA。
　　 3、Western blot檢測轉(zhuǎn)染組HEC-1A-s

6、iRNA細(xì)胞AT1-R蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組明顯降低，AT1-R蛋白表達(dá)的抑制率為41.79％。
　　 4、MTT檢測17β-E2作用10min能夠誘導(dǎo)HEC-1A細(xì)胞增殖，其增殖率為14.74％，AT1-R沉默后再用雌激素誘導(dǎo)，HEC-1A細(xì)胞增殖受到明顯抑制，其抑制率為29.34％。
　　 5、雌激素誘導(dǎo)10min能使HEC-1A細(xì)胞G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多；AT1-R沉默后再用雌激素作用10min，與未轉(zhuǎn)染雌激

7、素作用組相比，E2促進(jìn)HEC-1A細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化作用受到明顯抑制，G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少。
　　 6、雌激素誘導(dǎo)10min后，HEC-1A細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)水平升高；AT1-R沉默后再用雌激素誘導(dǎo)10min，ERK1/2蛋白表達(dá)較未轉(zhuǎn)染雌激素作用組顯著降低。
　　 7、雌激素誘導(dǎo)10min后，HEC-1A細(xì)胞ER蛋白表達(dá)無明顯變化；AT1-R沉默后再用雌激素誘導(dǎo)10min，ER蛋白表達(dá)也沒有受到抑制。