中藥蛋白酶抑制劑的篩選及防治急性肺損傷作用研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑(PI)廣泛存在于動植物和微生物中，在體內能抑制蛋白水解酶活性，在許多疾病及病理過程中有控制作用，如與炎癥、血液凝固、補體級聯(lián)反應、細胞調亡、激素調節(jié)等；現(xiàn)代藥理研究表明魚腥草具有增強機體免疫、抗病毒和抑癌等作用，臨床主要用于治療呼吸系統(tǒng)疾病如治療肺癰吐膿、痰熱喘咳，肺及氣管病變(氣管炎、肺炎、支氣管擴張、百日咳)。急性肺損傷(ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)或多臟器功能衰竭(MOF)的早期階段，是指由各種肺內、外致

2、病因素導致的急性進行性缺氧性呼吸衰竭。ALI的發(fā)病率和死亡率很高，在美國每年大約有10萬人發(fā)生ARDS，其病死率高達50～70％，是臨床上常見的死亡率極高的危重癥之一，是目前醫(yī)學界研究的一個熱點。為在中藥中尋找出安全有效的植物源蛋白酶抑制劑，并探討其作用和機理，本研究對60種中藥蛋白酶抑制劑的活性進行了篩選，并對魚腥草蛋白酶抑制劑組分防治急性肺損傷的作用和機理進行了研究，以期為臨床用藥提供科學依據(jù)。本論文的主要研究內容和結果如下：

3、 1 具有蛋白酶抑制劑活性的中藥篩選 本實驗以胰蛋白酶為底物，以大豆胰蛋白酶抑制劑為對照，對臨床應用較廣的60種中藥配方顆粒，大黃、魚腥草、麻黃、白芍、瓜蔞皮5種藥材的水、乙醇提取物的體外蛋白酶的抑制作用以及這5種中藥的水提取物進入體內的蛋白酶抑制劑活性進行了研究。研究結果顯示： (1)蛋白酶抑制劑活性較強的中藥集中在發(fā)散風寒藥及清熱解毒藥中。60種中藥配方顆粒中有13種中藥在100mg·mL<'-1>時蛋白酶抑制作用

4、較強，依次為三七、麻黃、大黃、白芍、魚腥草等；有9種中藥在50mg·mL<'-1>濃度下蛋白酶抑制作用較強，依次為茯苓、大黃、山豆根、麻黃、白芍、魚腥草、連翹等；其中麻黃、大黃、魚腥草、白芍、連翹5種中藥在上述兩濃度下均表現(xiàn)出蛋白酶抑制作用。 (2)大黃、魚腥草水提取液，麻黃、白芍的70％乙醇提取液的體外蛋白酶的抑制作用較強。大黃、魚腥草、麻黃3種中藥水提取液和70％乙醇提取液均有較強的蛋白酶抑制作用，瓜蔞皮的蛋白酶抑制作用不明

5、顯。 (3)大黃、魚腥草、麻黃、白芍、瓜蔞皮水提取物大鼠灌胃給藥，大黃、魚腥草的含藥血漿對胰蛋白酶的抑制作用較強，瓜蔞皮水提取物對胰蛋白酶的抑制作用不明顯。 2 魚腥草蛋白酶抑制劑組分的分離本實驗 采用正交試驗的方法，考查了影響魚腥草水提取物蛋白酶抑制活性的因素，確定了最佳提取條件為60℃，加30倍量水，在pH 9下煎煮3h，并以此條件對魚腥草進行提取，水提液減壓濃縮，離心除去沉淀，上清液氯仿萃取，水層過濾除去沉

6、淀后過大孔樹脂，分別用水、30％，50％，70％，95％乙醇洗脫大孔樹脂，得組分1、2、3、4、5。氯仿層過離子交換樹脂，氨水洗脫，得組分6。經試管法和薄層色譜法定性鑒別，組分1為多糖和苷類物質，組分2、3、4、5為黃酮類物質、組分6為生物堿。測定各組分對蛋白酶活性的抑制，結果表明：蛋白酶抑制劑活性最強的為組分6(生物堿)，其次是組分1(多糖類)和組分2、3、4、5(黃酮類)。 3 魚腥草蛋白酶抑制劑防治LPS誘導的大鼠急性肺損

7、傷實驗研究 本實驗采用LPS誘導的大鼠急性肺損傷(ALI)模型，研究魚腥草蛋白酶抑制劑對ALI的防治作用。結果顯示：魚腥草蛋白酶抑制劑能減輕LPS誘導的急性肺損傷大鼠肺間質增厚，減少肺間質和肺泡腔內出血、水腫及滲出物，降低肺間質中膠原纖維含量，減輕肺組織纖維性增生，改善肺損傷癥狀；魚腥草蛋白酶抑制劑能顯著降低ALI大鼠肺泡灌洗液中MDA含量及血清中IL-6、IL-8及TNF-α水平；有顯著降低ALI大鼠肺組織中HYP含量的趨勢；

8、顯著下調ALI大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9的含量和蛋白質表達。說明魚腥草蛋白酶抑制劑對ALI有一定的防治作用，其作用的機理可能是阻止了急性肺損傷的早期階段脂質過氧化過程，通過減少氧自由基和炎性因子的釋放，降低MMPs的活性，減少肺組織的損傷。 4 基因芯片技術研究魚腥草蛋白酶抑制劑對A549細胞基因表達譜的影響 本實驗采用肺泡上皮來源的A549癌細胞株替代肺泡Ⅱ型上皮細胞，用基因芯片技術檢測了魚腥草蛋白酶抑制劑對A

9、549細胞基因表達譜的影響。結果表明：有明顯差異表達的基因共有204條，占總檢測基因數(shù)的1.3％。其中上調的基因有139條，表達下調的基因有65條；與凋亡相關的基因上調的有25條，下調的有7條。在表達上調的基因中與細胞凋亡相關的基因其主要功能以下列形式出現(xiàn)：信號轉導、腫瘤抑制、蛋白表邊轉錄因子、細胞分裂/細胞凋亡、細胞骨架/運動蛋白、新陳代謝/蛋白質水解、細胞因子/化學因子、膜蛋白、轉錄相關蛋白和蛋白酶抑制劑等。在表達下調的基因中與細胞

10、凋亡相關的基因其主要功能以下列形式出現(xiàn)：細胞分裂/細胞凋亡、信號轉導、細胞周期和癌基因等。說明魚腥草蛋白酶抑制劑對細胞結構和功能基因、細胞信號轉導相關基因、細胞代謝基因、轉錄和轉錄因子類基因以及蛋白質翻譯合成類相關基因有調節(jié)作用。 結論：蛋白酶抑制劑活性較強的中藥集中在發(fā)散風寒藥及清熱解毒藥，其中作用明顯的有：三七、大黃、魚腥草、麻黃、白芍、茯苓、山豆根、連翹等；魚腥草含有蛋白酶抑制劑活性組分，蛋白酶抑制劑活性最強的為生物堿，其

11、次是多糖或糖苷，極性強的黃酮類成分，蛋白酶抑制劑活性較強，弱極性的黃酮類化合物，蛋白酶抑制劑活性相對較弱；魚腥草蛋白酶抑制劑能降低急性肺損傷大鼠肺組織脂質過氧化水平，增強抗氧化能力，減少氧自由基和炎性因子的釋放，降低肺組織中MMP-2、MMP-9的活性，從而對急性肺損傷有一定的防治作用；魚腥草蛋白酶抑制劑對肺泡上皮細胞來源的A549細胞的細胞結構和功能基因、細胞信號轉導相關基因、細胞代謝基因、轉錄和轉錄因子類基因以及蛋白質翻譯合成類相關