中藥蛋白酶抑制劑的篩選及防治急性肺損傷作用研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑(PI)廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，在體內(nèi)能抑制蛋白水解酶活性，在許多疾病及病理過(guò)程中有控制作用，如與炎癥、血液凝固、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞調(diào)亡、激素調(diào)節(jié)等；現(xiàn)代藥理研究表明魚腥草具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗病毒和抑癌等作用，臨床主要用于治療呼吸系統(tǒng)疾病如治療肺癰吐膿、痰熱喘咳，肺及氣管病變(氣管炎、肺炎、支氣管擴(kuò)張、百日咳)。急性肺損傷(ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)或多臟器功能衰竭(MOF)的早期階段，是指由各種肺內(nèi)、外致

2、病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭。ALI的發(fā)病率和死亡率很高，在美國(guó)每年大約有10萬(wàn)人發(fā)生ARDS，其病死率高達(dá)50～70％，是臨床上常見的死亡率極高的危重癥之一，是目前醫(yī)學(xué)界研究的一個(gè)熱點(diǎn)。為在中藥中尋找出安全有效的植物源蛋白酶抑制劑，并探討其作用和機(jī)理，本研究對(duì)60種中藥蛋白酶抑制劑的活性進(jìn)行了篩選，并對(duì)魚腥草蛋白酶抑制劑組分防治急性肺損傷的作用和機(jī)理進(jìn)行了研究，以期為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。本論文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：

3、 1 具有蛋白酶抑制劑活性的中藥篩選 本實(shí)驗(yàn)以胰蛋白酶為底物，以大豆胰蛋白酶抑制劑為對(duì)照，對(duì)臨床應(yīng)用較廣的60種中藥配方顆粒，大黃、魚腥草、麻黃、白芍、瓜蔞皮5種藥材的水、乙醇提取物的體外蛋白酶的抑制作用以及這5種中藥的水提取物進(jìn)入體內(nèi)的蛋白酶抑制劑活性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示： (1)蛋白酶抑制劑活性較強(qiáng)的中藥集中在發(fā)散風(fēng)寒藥及清熱解毒藥中。60種中藥配方顆粒中有13種中藥在100mg·mL<'-1>時(shí)蛋白酶抑制作用

4、較強(qiáng)，依次為三七、麻黃、大黃、白芍、魚腥草等；有9種中藥在50mg·mL<'-1>濃度下蛋白酶抑制作用較強(qiáng)，依次為茯苓、大黃、山豆根、麻黃、白芍、魚腥草、連翹等；其中麻黃、大黃、魚腥草、白芍、連翹5種中藥在上述兩濃度下均表現(xiàn)出蛋白酶抑制作用。 (2)大黃、魚腥草水提取液，麻黃、白芍的70％乙醇提取液的體外蛋白酶的抑制作用較強(qiáng)。大黃、魚腥草、麻黃3種中藥水提取液和70％乙醇提取液均有較強(qiáng)的蛋白酶抑制作用，瓜蔞皮的蛋白酶抑制作用不明

5、顯。 (3)大黃、魚腥草、麻黃、白芍、瓜蔞皮水提取物大鼠灌胃給藥，大黃、魚腥草的含藥血漿對(duì)胰蛋白酶的抑制作用較強(qiáng)，瓜蔞皮水提取物對(duì)胰蛋白酶的抑制作用不明顯。 2 魚腥草蛋白酶抑制劑組分的分離本實(shí)驗(yàn) 采用正交試驗(yàn)的方法，考查了影響魚腥草水提取物蛋白酶抑制活性的因素，確定了最佳提取條件為60℃，加30倍量水，在pH 9下煎煮3h，并以此條件對(duì)魚腥草進(jìn)行提取，水提液減壓濃縮，離心除去沉淀，上清液氯仿萃取，水層過(guò)濾除去沉

6、淀后過(guò)大孔樹脂，分別用水、30％，50％，70％，95％乙醇洗脫大孔樹脂，得組分1、2、3、4、5。氯仿層過(guò)離子交換樹脂，氨水洗脫，得組分6。經(jīng)試管法和薄層色譜法定性鑒別，組分1為多糖和苷類物質(zhì)，組分2、3、4、5為黃酮類物質(zhì)、組分6為生物堿。測(cè)定各組分對(duì)蛋白酶活性的抑制，結(jié)果表明：蛋白酶抑制劑活性最強(qiáng)的為組分6(生物堿)，其次是組分1(多糖類)和組分2、3、4、5(黃酮類)。 3 魚腥草蛋白酶抑制劑防治LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損

7、傷實(shí)驗(yàn)研究 本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷(ALI)模型，研究魚腥草蛋白酶抑制劑對(duì)ALI的防治作用。結(jié)果顯示：魚腥草蛋白酶抑制劑能減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺間質(zhì)增厚，減少肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)出血、水腫及滲出物，降低肺間質(zhì)中膠原纖維含量，減輕肺組織纖維性增生，改善肺損傷癥狀；魚腥草蛋白酶抑制劑能顯著降低ALI大鼠肺泡灌洗液中MDA含量及血清中IL-6、IL-8及TNF-α水平；有顯著降低ALI大鼠肺組織中HYP含量的趨勢(shì)；

8、顯著下調(diào)ALI大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9的含量和蛋白質(zhì)表達(dá)。說(shuō)明魚腥草蛋白酶抑制劑對(duì)ALI有一定的防治作用，其作用的機(jī)理可能是阻止了急性肺損傷的早期階段脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，通過(guò)減少氧自由基和炎性因子的釋放，降低MMPs的活性，減少肺組織的損傷。 4 基因芯片技術(shù)研究魚腥草蛋白酶抑制劑對(duì)A549細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響 本實(shí)驗(yàn)采用肺泡上皮來(lái)源的A549癌細(xì)胞株替代肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了魚腥草蛋白酶抑制劑對(duì)A

9、549細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果表明：有明顯差異表達(dá)的基因共有204條，占總檢測(cè)基因數(shù)的1.3％。其中上調(diào)的基因有139條，表達(dá)下調(diào)的基因有65條；與凋亡相關(guān)的基因上調(diào)的有25條，下調(diào)的有7條。在表達(dá)上調(diào)的基因中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因其主要功能以下列形式出現(xiàn)：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤抑制、蛋白表邊轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞分裂/細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架/運(yùn)動(dòng)蛋白、新陳代謝/蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞因子/化學(xué)因子、膜蛋白、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白和蛋白酶抑制劑等。在表達(dá)下調(diào)的基因中與細(xì)胞

10、凋亡相關(guān)的基因其主要功能以下列形式出現(xiàn)：細(xì)胞分裂/細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期和癌基因等。說(shuō)明魚腥草蛋白酶抑制劑對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能基因、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、細(xì)胞代謝基因、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子類基因以及蛋白質(zhì)翻譯合成類相關(guān)基因有調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論：蛋白酶抑制劑活性較強(qiáng)的中藥集中在發(fā)散風(fēng)寒藥及清熱解毒藥，其中作用明顯的有：三七、大黃、魚腥草、麻黃、白芍、茯苓、山豆根、連翹等；魚腥草含有蛋白酶抑制劑活性組分，蛋白酶抑制劑活性最強(qiáng)的為生物堿，其

11、次是多糖或糖苷，極性強(qiáng)的黃酮類成分，蛋白酶抑制劑活性較強(qiáng)，弱極性的黃酮類化合物，蛋白酶抑制劑活性相對(duì)較弱；魚腥草蛋白酶抑制劑能降低急性肺損傷大鼠肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平，增強(qiáng)抗氧化能力，減少氧自由基和炎性因子的釋放，降低肺組織中MMP-2、MMP-9的活性，從而對(duì)急性肺損傷有一定的防治作用；魚腥草蛋白酶抑制劑對(duì)肺泡上皮細(xì)胞來(lái)源的A549細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能基因、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、細(xì)胞代謝基因、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子類基因以及蛋白質(zhì)翻譯合成類相關(guān)