人毛乳頭細(xì)胞永生化的實驗研究.pdf

1、背景： 毛乳頭細(xì)胞(dermalpapillacells，DPC)在毛囊形態(tài)發(fā)生、生長周期調(diào)控及維持毛發(fā)生長發(fā)育中起重要作用，并具有在體內(nèi)外條件下重建毛囊的功能。DPC功能的異常變化是導(dǎo)致毛囊周期失衡和脫發(fā)現(xiàn)象的主要起始因素。對DPC生物學(xué)功能變化的調(diào)控機制進行深入研究對毛囊生物學(xué)和毛發(fā)疾病的研究都有重大的意義。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程皮膚的研究和應(yīng)用得到長足進展，目前已有多種商品化產(chǎn)品出售并用于臨床。但目前以成纖維細(xì)胞

2、和角質(zhì)形成細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚沒有毛囊等皮膚附屬器官，在組織結(jié)構(gòu)和功能上與正常皮膚組織仍有較大差異。利用DPC誘導(dǎo)毛囊形成的特性，將其作為種子細(xì)胞在組織工程皮膚上重建毛囊，形成含有毛囊結(jié)構(gòu)的人工皮膚替代物，將極大提高創(chuàng)傷愈合的質(zhì)量。但DPC標(biāo)本不易獲得，其在通常的體外培養(yǎng)條件下經(jīng)過十幾次的傳代后會停止增殖，出現(xiàn)衰老和死亡，且隨著體外培養(yǎng)傳代次數(shù)增多會逐漸失去其固有的一些生物學(xué)特性和功能，極大地限制了其研究和應(yīng)用。 建

3、立永生化細(xì)胞系是解決體外培養(yǎng)條件下細(xì)胞衰老的一種常用手段。然而，以往建立細(xì)胞系的方法大多是通過轉(zhuǎn)染病毒基因或癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，通過這些方法建立的細(xì)胞系有許多局限性：其基因整合是隨機性的，轉(zhuǎn)染獲得的是轉(zhuǎn)化細(xì)胞而非正常細(xì)胞，其表型、核型等可發(fā)生改變。且有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系僅通過了M1期，壽命延長，而并非永生化。研究表明，端粒酶的激活可以延緩細(xì)胞衰老，甚至使細(xì)胞永生化。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscr

4、iptase，hTERT，)作為端粒酶的催化亞單位和和限速酶，在端粒酶活性維持中起關(guān)鍵作用。將外源性hTERT基因轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，可誘導(dǎo)細(xì)胞端粒酶活性，使細(xì)胞永生化。hTERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系保留了更多正常細(xì)胞的生物學(xué)特征。另外，hTERT’介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系已逾越M2期，同胚胎干細(xì)胞一樣，是真正意義上的永生化。為此，本研究將外源性hTERT基因?qū)塍w外培養(yǎng)的正常人DPC，擬建立永生化人DPC系，并進一步分析該細(xì)胞系的生物學(xué)和功能學(xué)特征

5、，以期為DPC的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供充足的、穩(wěn)定的和正常的細(xì)胞來源。 目的： 1.建立永生化人DPC系。 2.觀察體外培養(yǎng)條件下該細(xì)胞系的生物學(xué)和功能學(xué)特征。 3.觀察該細(xì)胞系在體內(nèi)誘導(dǎo)毛囊形成的能力。 方法： 1.采用我科建立的“酶消化法”分離培養(yǎng)正常人DPC，觀察體外培養(yǎng)DPC形態(tài)和生長情況并行α平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)免疫組化染色鑒定。

6、 2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將空載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT分別導(dǎo)入體外培養(yǎng)的第3代正常人DPC，經(jīng)G418篩選得到陽性克隆，連續(xù)傳代培養(yǎng)。分別采用PCR和RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)hTERT基因的整合與表達(dá)，采用端粒酶重復(fù)序列擴增(TRAP)-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的端粒酶活性。 3.取轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hTERT第30代DPC，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)

7、胞形態(tài)和生長情況，采用免疫組化檢測α-SMA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，采用細(xì)胞生長曲線分析和細(xì)胞周期測定觀察細(xì)胞的增殖特征，采用染色體核型分析、軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠致瘤實驗觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)化特征，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)濃度觀察細(xì)胞的分泌功能。 4.將轉(zhuǎn)染pIRES2-E

8、GFP-hTERT第30代DPC與剛分離的毛囊上皮細(xì)胞混合后直接注射到裸鼠背部皮下觀察其在體內(nèi)誘導(dǎo)毛囊形成的能力。 結(jié)果： 1.采用我科建立的“酶消化法”分離培養(yǎng)了正常人DPC，體外培養(yǎng)的DPC形態(tài)上類似成纖維細(xì)胞，單個細(xì)胞的形態(tài)呈梭形，體積較大，具有明顯的多層凝集性生長特性，表達(dá)體外培養(yǎng).DPC的特異性標(biāo)記物α-SMA。 2.利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將空載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP和含有hTERT

9、基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT分別導(dǎo)入體外培養(yǎng)的正常人DPC，經(jīng)G418篩選3周后轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP組和質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT組各出現(xiàn)1個陽性細(xì)胞克隆，分別命名為DPC-EGFP和DPC-hTERT。濾紙片法將細(xì)胞克隆移至24孔板擴大培養(yǎng)后DPC-EGFP細(xì)胞生長增殖能力較差，傳至12代后細(xì)胞發(fā)生衰老、死亡。而DPC-hTERT細(xì)胞擴大培養(yǎng)后生長良好，增殖能力強，現(xiàn)已連續(xù)傳至65代，傳代中

10、細(xì)胞生長增殖速度無明顯變化。檢測發(fā)現(xiàn)DPC和DPC-EGFP細(xì)胞無hTERT基因的整合與表達(dá)，端粒酶活性為陰性；而DPC-hTERT細(xì)胞穩(wěn)定整合與表達(dá)hTERT，同時端粒酶活性轉(zhuǎn)為陽性。 3.DPC.hTERT形態(tài)和生長特性與低代DPC基本相同，α-SMA免疫組化染色陽性，生長增殖活躍，無明顯轉(zhuǎn)化特征，染色體核型正常，在軟瓊脂內(nèi)不能生長，無裸鼠致瘤性，具有正常DPC的分泌功能。 4.DPC-hTERT與剛分離的毛囊上皮細(xì)

11、胞混合后注射到裸鼠背部皮下能誘導(dǎo)內(nèi)含較多細(xì)胞和色素顆粒的表皮囊腫結(jié)構(gòu)形成。 結(jié)論： 1.我們利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將外源性hTERT基因?qū)塍w外培養(yǎng)的正常人DPC，成功地建立了永生化人DPC系DPC-hTERT。 2.DPC-hTERT基本上是正常細(xì)胞而無明顯轉(zhuǎn)化特征，保持了正常人DPC的生物學(xué)和功能學(xué)特征?？赏麨樯钊胙芯緿PC生物學(xué)功能變化的調(diào)控機制提供理想的細(xì)胞模型，為構(gòu)建含有毛囊等附件的全功能