大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞原代培養(yǎng)及永生化研究.pdf

1、Müller細胞是視網(wǎng)膜中主要的神經(jīng)膠質細胞。以往人們認為，Müller細胞通過發(fā)出分支包圍、分隔神經(jīng)元的胞體和突起而對神經(jīng)元起支持和營養(yǎng)作用。近來研究表明Müller細胞還具有維持細胞外微環(huán)境平衡和調節(jié)神經(jīng)元細胞活動等作用。在外傷性增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變等眼病中，Müller細胞通過表達一些生長因子與該疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關。該細胞在視網(wǎng)膜中的作用正日益受到人們的重視。但由于原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜膠質細胞傳代次數(shù)有限，制約了進一步的研究。

2、 細胞永生化最常用的方法是基因轉染，SV40 Tag基因是較為常用的體外永生化目的基因片段之一。猴病毒40(simianvirus40，sv40)為雙股環(huán)狀。DNA病毒，是1960年在用猴腎細胞培養(yǎng)制備脊髓灰質炎病毒疫苗過程中發(fā)現(xiàn)的，它由結構蛋白(VP1、VP2、VP3)和SV40早期轉錄區(qū)基因編碼的大T和小t抗原組成。大T抗原為細胞轉化啟動所必需，而且轉化細胞表型的維持必須有大T抗原的連續(xù)表達。 本研究以酶消化法原代培

3、養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞，采用逆轉錄病毒載體的方法將大T抗原轉染入其中，擬建立永生化視網(wǎng)膜膠質細胞系，并對轉染后的細胞在動物眼玻璃體腔內生長進行了觀察。大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞系的建立將為進一步研究增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)、糖尿病玻璃體視網(wǎng)膜病變(PDR)等提供理想的細胞來源。 一研究目的： 利用酶消化法原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞，以SV40大T抗原(SV40LT)轉染之，擬建立永生化大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞系，并對其生物學性

4、狀進行研究。 二實驗方法： 1、酶消化法體外原代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT比色法繪制細胞生長曲線，免疫組織化學對細胞進行鑒定。 2、通過Lipofeetomin2000轉染攜帶SV40LT抗原的質粒進入第三代原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞，潮霉素篩選并傳代；相差顯微鏡和MTT比色法觀察轉染后細胞生長及增殖情況；免疫組織化學和RT-PCR檢測永生化大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞SV40大T抗原、GFA

5、P、VIM表達。 3、將轉染SV40LT抗原后的膠質細胞注射入大鼠玻璃體腔，HE染色觀察其在眼內生長情況，免疫組織化學鑒定細胞成分。 三．實驗結果： 1、利用酶消化法成功原代培養(yǎng)出大鼠視網(wǎng)膜膠質細胞。視網(wǎng)膜膠質細胞培養(yǎng)貼壁生長，細胞呈星形、不規(guī)則形，消化后的細胞呈圓或橢圓形。傳至第三代時，經(jīng)免疫組化鑒定，Müller細胞已占98％以上。傳代至第10代，出現(xiàn)細胞生長緩慢甚至停滯，傳代后不生長。 2、轉染SV

6、40大T抗原后的視網(wǎng)膜膠質細胞生長旺盛，可反復傳代，目前已達30代。倒置顯微鏡下，細胞為單層貼壁生長，形態(tài)呈多角形、啞鈴形等典型的膠質細胞樣特征。免疫組化染色GFAP，VIM，SV40LT呈陽性表達。RT—PCR擴增檢測GFAP，VIM，SV40LT出現(xiàn)陽性條帶。 3、轉染后的視網(wǎng)膜膠質細胞注入大鼠玻璃體腔，能生長存活，位于晶狀體后視網(wǎng)膜前，呈膜樣。免疫組化鑒定顯示構成該膜的細胞以GFAP、VIM陽性細胞為主。 四結論：