山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及永生化的研究.pdf

1、分離培養(yǎng)原代細(xì)胞費(fèi)時(shí)費(fèi)力，花費(fèi)高，且傳代次數(shù)有限，細(xì)胞生理功能容易變異，造成不同試驗(yàn)結(jié)果間因細(xì)胞培養(yǎng)代次不一而難以比較，從而限制其進(jìn)一步研究。研究表明：永生化細(xì)胞系具有許多原代細(xì)胞所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，如細(xì)胞的均一性、穩(wěn)定性及操作簡(jiǎn)便等特性，為了克服山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(Endometrial Stromal Cells，ESCs)在體外培養(yǎng)時(shí)的缺點(diǎn)，為研究子宮局部免疫等功能提供大量均一的種子細(xì)胞，本試驗(yàn)進(jìn)行了山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及永生

2、化的研究。獲得以下結(jié)果： 1.采用膠原酶Ⅱ消化-低速離心-自然沉降的方法分離山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特性進(jìn)行檢測(cè)及細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明：分離得到的ESCs純度可達(dá)95％以上。以1×106個(gè)/mL密度接種培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞貼壁，5 d左右可鋪滿皿底，細(xì)胞呈梭形和三角形，匯合呈漩渦狀生長(zhǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，有接觸抑制性。波形蛋白檢測(cè)陽(yáng)性，角蛋白檢測(cè)陰性，證

3、明分離得到的細(xì)胞為ESCs。 2.經(jīng)濃度梯度篩選確定轉(zhuǎn)染用G418最佳濃度為600μg/mL。利用提取純化的pCI-neo-hTERT基因的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)二代的山羊ESCs。經(jīng)G418篩選共獲得5個(gè)細(xì)胞克隆，分別命名為A5、B5、B6、C4、C6?？寺5、B5、C6來(lái)源的細(xì)胞在體外長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)下，生長(zhǎng)良好，其中A5至今已傳至50代。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)端粒酶催化亞單位顯示陽(yáng)性，說(shuō)明外源性hTERT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入山羊

4、ESCs中。利用PCR-ELISA技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)染后第20代、第50代細(xì)胞中的端粒酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果在轉(zhuǎn)染hTERT的細(xì)胞中均檢測(cè)到較強(qiáng)的端粒酶活性，而原代培養(yǎng)的細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到。表明外源性hTERT基因可以激活山羊ESCs的端粒酶活性。 4.通過(guò)對(duì)ESCs的重要表面標(biāo)志物進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)和培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞具有原代細(xì)胞的表型特性。通過(guò)繪制轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和培養(yǎng)觀察，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞仍具有正常的細(xì)胞增殖周期和

5、接觸抑制性。轉(zhuǎn)染后ESCs和未轉(zhuǎn)染。ESCs軟瓊脂內(nèi)培養(yǎng)均不形成克隆。證明：轉(zhuǎn)染的ESCs基本為正常細(xì)胞，無(wú)轉(zhuǎn)化特征，保持了原代山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性。 5.用MTT法檢測(cè)不同濃度不同組合的雌激素(E2)和孕激素(P4)對(duì)轉(zhuǎn)染后ESCs的增殖作用的影響。結(jié)果表明：E2/P4為100/0nmol/L，和100/10nmol/L，時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖作用較明顯。 本試驗(yàn)在成功分離培養(yǎng)山羊ESCs基礎(chǔ)上，將hTERT導(dǎo)