遲緩愛(ài)德華菌溶血活化基因（eha）功能的研究.pdf

1、目的：遲緩愛(ài)德華菌(Edwardsiella trada，簡(jiǎn)稱Et)是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的病原菌，能引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，如魚類、鰻魚、龜鱉、牛蛙等的疾病。遲緩愛(ài)德華菌還是一種人畜共患病的病原菌，是愛(ài)德華菌屬中唯一感染人的成員。預(yù)防和治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物遲緩愛(ài)德華菌感染主要使用抗生素，這涉及到食品的安全問(wèn)題。接種疫苗作為一種安全可靠的預(yù)防手段，已得到大家的公認(rèn)，但目前尚無(wú)有效疫苗的應(yīng)用。盡管已發(fā)現(xiàn)Et的一些重要的致病因子，如溶血素、載鐵體、腸

2、毒素等，但其致病機(jī)理仍不明確。因此，對(duì)遲緩愛(ài)德華菌的毒力因子及其調(diào)控的進(jìn)一步研究，有助于發(fā)現(xiàn)新的致病機(jī)制和疫苗靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Et溶血素活化基因(Et haemolysin activator gene，eha)的生物學(xué)特性和調(diào)控作用，并構(gòu)建其缺失株。 方法：構(gòu)建重組載體pET28a<'+>.eha，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，利用IPTG誘導(dǎo)大腸埃希菌表達(dá)EHA蛋白，菌體超聲裂解物經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，檢測(cè)其純化蛋白

3、溶血活性及Vero細(xì)胞毒性。將eha重組質(zhì)粒pED101和載體pACYC184分別轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH 5α中，利用RT-PCR及SDS-PAGE電泳，觀察eha基因調(diào)控大腸埃希菌染色體上的細(xì)胞毒clyA基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。構(gòu)建eha基因重組自殺質(zhì)粒，利用同源重組原理，缺失Et的eha基因，并用PCR證實(shí)。 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET28a<'+>-eha重組質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)出一條17 kDa左右的條

4、帶，純化蛋白無(wú)溶血性及Vero細(xì)胞毒性。將eha重組質(zhì)粒pEDl01轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH 5α中，其克隆子表現(xiàn)出溶血性，SDS-PAGE電泳顯示克隆子有一條30 kDa左右的蛋白條帶，與clyA蛋白分子量一致，RT-PCR顯示其有約1000 bp的條帶，也與clyA符合，而載體pACYC184轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH 5α中，其克隆子無(wú)溶血性，SDS-PAGE電泳和RT-PCR均未顯示相應(yīng)的條帶。成功構(gòu)建了eha基因重組自殺質(zhì)粒，通過(guò)電轉(zhuǎn)，