致病性遲緩愛德華氏菌PCR檢測體系的建立及其mukF毒力基因的克隆表達(dá).pdf

1、僅在致病性遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)國外分離株中發(fā)現(xiàn)的毒力基因有7種，分別為orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF、esrB，其中orfA基因的序列未提交，故無法根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物。本試驗(yàn)確定了另外6個(gè)毒力基因在國內(nèi)分離株中的分布情況，篩選出可用于檢測致病性遲緩愛德華氏菌的毒力基因，最終建立致病性遲緩愛德華氏菌的PCR檢測體系。根據(jù)這6個(gè)毒力基因序列，設(shè)計(jì)了6對引物，經(jīng)擴(kuò)增結(jié)果如下：citC

2、、fimA、gadB和mukF均出現(xiàn)與目的基因大小一致的條帶，經(jīng)測序驗(yàn)證為目的條帶；katB和esrB未擴(kuò)增出目的條帶。為了進(jìn)一步驗(yàn)證沒有擴(kuò)增出katB和esrB基因是否引物問題，引用相關(guān)文獻(xiàn)上katB和esrB基因引物和反應(yīng)體系條件再次擴(kuò)增，也未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。試驗(yàn)結(jié)果顯示：在citC、fimA、gadB和mukF這4個(gè)毒力基因特異性試驗(yàn)中，其它常見致病菌沒有擴(kuò)增出與目的基因片段大小相近的條帶，引物特異性良好。各毒力基因單重PCR的靈敏

3、度結(jié)果：gadB基因可檢測到模板濃度為100fg/μL，其余3個(gè)毒力基因均可檢測到的模板濃度為10pg/μL；二重PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明：與單重PCR的靈敏度一致，fimA/gadB靈敏度略優(yōu)于citC/mukF。毒力基因在國外分離株中和13株國內(nèi)分離株中的分布情況存在差異：gadB和mukF在已經(jīng)檢測的國內(nèi)分離株中均出現(xiàn)，其余的出現(xiàn)情況分別為：fimA基因出現(xiàn)在其中的8株，citC基因出現(xiàn)在其中的7株。從引物靈敏度試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)以

4、及毒力基因在國內(nèi)分離株的分布情況三方面綜合考慮，最終選用fimA/gadB二重。PCR體系作為致病性遲緩愛德華氏菌的檢測體系。遲緩愛德華氏菌檢測體系的建立對于包括鰻魚在內(nèi)的水產(chǎn)疾病的診斷、防治有著重要的實(shí)際意義。 mukF基因是遲緩愛德華氏菌重要的毒力基因，其功能為殺傷作用，由此克隆表達(dá)mukF毒力基因，并籍此制備抗原疫苗，有助于預(yù)防遲緩愛德華氏菌引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物愛德華氏菌病。本試驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的遲緩愛德華氏菌mukF毒力基因序

5、列(AY0785lO)，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增出540bp大小的片段，定向克隆至克隆載體pblue，酶切鑒定后進(jìn)行序列測定和分析。結(jié)果表明：與國外參考株(AY078510)同源性達(dá)到87.8％，分析推導(dǎo)其核苷酸編碼的氨基酸序列顯示：氨基酸其同源性為93.3％，其編碼180個(gè)氨基酸，共有12個(gè)氨基酸發(fā)生變化，且基本均勻分布于序列中間。將其與pET30a(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化了BL21工程菌株，經(jīng)SDS-PAGE分析表明：29KD附近出現(xiàn)一