eha基因?qū)t緩愛德華菌及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的影響.pdf

1、EffectsofehagenetoEdwardsiellatardaandit’SsurvivinginMacrophagesADissertationSubmitiedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofMedicineBYLIYuhongSupervisedbyAssociatedProfessorGAODaqingSchooIofMedicineSoutheast

2、UniversityMay2013中文摘要幽a基因?qū)t緩愛德華菌及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的影響中文摘要遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda，簡稱Et)是一種重要的人獸共患病原菌，能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖，是其致病的關(guān)鍵。Et溶血調(diào)控基因(Ethaemolysinactivatorgene，簡稱eha)是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，能夠調(diào)控Et的某些毒力因子。已有研究表明，eha基因可能與Et的胞內(nèi)生存有關(guān)，但是該基因如何影響該菌的

3、胞內(nèi)生存機(jī)制及其毒力尚未闡明。WST-8和LDH細(xì)胞毒性檢測結(jié)果均表明，野生株的細(xì)胞毒性明顯高于eha缺失株，在電鏡和倒置光學(xué)顯微鏡下也觀察到這一現(xiàn)象。eha缺失株在SDS和多粘菌素B脅迫環(huán)境中的存活率明顯降低，表明eha基因的缺失可能影響Et菌體相關(guān)成分的合成。RT-PCR結(jié)果表明，野生株中外膜蛋白基因pagC的轉(zhuǎn)錄水平高于eha缺失株；qRT-PCR結(jié)果顯示eha缺失株dOpagC的轉(zhuǎn)錄水平為野生株的045倍。SDSPAGE電泳也顯

4、示，野生株的三種外膜蛋白表達(dá)水平高于eha缺失株，其中37kD外膜蛋白是誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫保護(hù)抗體的重要抗原。因此，eha基因通過影響Et菌體相關(guān)成分的合成，影響Et菌在脅迫環(huán)境中的存活率。流式凋亡檢測和電鏡觀察結(jié)果顯示，eha缺失株感染細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡率高于野生株感染細(xì)胞組，提示eha基因可抑制Et引起巨噬細(xì)胞凋亡的作用。RT-PCR結(jié)果顯示，eha基因上調(diào)Et中Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白C和鞭毛蛋白C的表達(dá)，而Ⅲ型分泌系統(tǒng)可抑制宿主細(xì)胞的

5、凋亡。但是eha基因是否通過調(diào)控IⅡ型分泌系統(tǒng)的表達(dá)而影響Et對巨噬細(xì)胞的凋亡作用，還有待探討。通過Et感染RAW2647細(xì)胞，菌落計(jì)數(shù)法測定其胞內(nèi)存活及電鏡、光鏡觀察結(jié)果表明，野生株和eha缺失株均可在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖，但和野生株相比，eha缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖速率明顯下降。模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)氧化環(huán)境的應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比野生株，eha缺失株對過氧化氫的敏感性顯著提高，在過氧化氫中的存活率明顯降低。流式檢測細(xì)菌感染后巨噬細(xì)胞產(chǎn)

6、生活性氧的水平，結(jié)果顯示，eha缺失株感染細(xì)胞組(6549％)高于野生株組(5532％)。進(jìn)一步用RT-PCR和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，eha基因的缺失下調(diào)了Et中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的轉(zhuǎn)錄水平；eha缺失株中sodC和勛燈的轉(zhuǎn)錄水平分別為野生株的01倍和042倍。這提示eha基因通過調(diào)控Et中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的表達(dá)，從而影響其分解巨噬細(xì)胞中活性氧的能力和在不同濃度過氧化氫中的存活率。模擬巨噬細(xì)胞吞噬溶酶體中酸性環(huán)境