丹參對(duì)肝臟缺血再灌注不同時(shí)限胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景： 在肝外傷、肝切除、肝移植以及多器官功能衰竭救治領(lǐng)域中，肝臟缺血再灌注損傷是造成肝功能損害的重要因素，其損傷機(jī)理及臟器保護(hù)研究始終是肝臟外科、創(chuàng)傷外科，移植外科的重要方向。缺血再灌注損傷是一個(gè)受多因素調(diào)節(jié)和影響的過程。復(fù)氧過程中活性氧的產(chǎn)生，Kupffer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化，引起一系列損害性的細(xì)胞反應(yīng)，繼而導(dǎo)致炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。同時(shí)，由于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損害，產(chǎn)生微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重了肝臟的局部缺血。在

2、缺血再灌注過程中，許多細(xì)胞因子和激素的表達(dá)水平都發(fā)生了改變，并在其中發(fā)揮不同的作用，如一氧化氮(NO)、熱休克蛋白(HSP)、內(nèi)皮素(ET)、缺氧誘導(dǎo)因子-I(HIF-I)、胰島素樣生長因子-I等。其中，胰島素樣生長因子(insulin-likegrowthfactor，IGF)的作用得到了越來越多的重視。IGF是一類既有胰島素樣合成代謝作用，又有促生長作用的多肽，它們?cè)跈C(jī)體組織細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化及抑制細(xì)胞凋亡中起重要作用，是許多組

3、織生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子，它還對(duì)不同的代謝產(chǎn)物、糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程起胰島素樣作用。近年來，IGF-I在肝外傷、肝臟手術(shù)以及多器官功能衰竭中的異常表達(dá)開始引起人們的關(guān)注，而關(guān)于IGF-I與肝臟缺血再灌注損傷的關(guān)系，它在肝臟缺血再灌注期表達(dá)的時(shí)空分布特點(diǎn)及其作用意義，尚未能最后闡明。 丹參為我國傳統(tǒng)活血祛瘀中藥，已有諸多研究表明丹參對(duì)重要臟器組織缺血再灌注損傷有較好的保護(hù)作用，這一原理主要為兩方面，其一是改善微循環(huán)灌注不足及抗氧自

4、由基作用，其二是可以降低肝細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度，減輕由于鈣超載引起的細(xì)胞損傷。而丹參的這些對(duì)肝臟的保護(hù)作用與IGF-I是否有一定內(nèi)在聯(lián)系，還無人知曉。 本課題在以往前期研究工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行肝缺血再灌注期IGF-I表達(dá)的研究，整體實(shí)驗(yàn)工作分為兩部分：第一部分通過建立大鼠肝臟缺血再灌注模型，觀察肝缺血再灌注不同時(shí)限中IGF-I及Caspase-3的表達(dá)特點(diǎn)，了解肝臟缺血再灌注IGF-I與肝臟功能及細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討其時(shí)空表達(dá)

5、特點(diǎn)及作用意義。第二部分通過對(duì)比分析丹參預(yù)處理組與未處理組IGF-I、Caspase-3表達(dá)的不同特點(diǎn)，研究丹參對(duì)肝臟缺血再灌注損傷不同時(shí)限胰島素樣生長因子-I表達(dá)的影響及意義。研究工作的目的旨在了解肝臟缺血再灌注期IGF-I表達(dá)的時(shí)空特點(diǎn)及作用意義，以及國藥丹參對(duì)肝臟缺血再灌注時(shí)IGF-I表達(dá)的影響，從而為肝缺血再灌注損傷的防治探索新的方向。 目的： 建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，觀察肝缺血再灌注不同時(shí)限中IGF-I

6、及Caspase-3的表達(dá)特點(diǎn)并了解IGF-I在肝缺血再灌注損傷時(shí)的時(shí)空分布特點(diǎn)及作用意義。 方法： 1.健康純系SD大鼠75只隨機(jī)分為3組，正常組(n=25只)，假手術(shù)組(n=25只)及缺血再灌注組(n=25只)，各組內(nèi)又根據(jù)再灌注后不同時(shí)間(0h、3h、12h、24h、72h)分為5個(gè)亞組，每組5只。 2.術(shù)前禁食12h，自由飲水。腹腔麻醉生效后，常規(guī)備皮、消毒，正常組進(jìn)腹后直接切取肝組織待測(cè)，假手術(shù)組僅解剖

7、肝門；缺血再灌注組在肝十二指腸韌帶遠(yuǎn)心端安置無損傷動(dòng)脈鉗鉗夾肝蒂45min，于不同復(fù)流時(shí)間(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝組織制備免疫組化及光鏡、電鏡觀察標(biāo)本，肝上下腔靜脈取血測(cè)定生化指標(biāo)。 3.IGF-I及Caspase-3免疫組化檢測(cè)依說明書進(jìn)行。胞漿呈胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。血清ALT和AST采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)

8、。用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察肝組織細(xì)胞及細(xì)胞器病理形態(tài)學(xué)變化。 4.用SPSS13.0進(jìn)行分析。采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較用單因素方差分析，多重比較用LSD法。P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。 結(jié)果： 正常組及假手術(shù)組各時(shí)限點(diǎn)IGF-I表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。損傷組再灌注0h時(shí)IGF-I表達(dá)下降，3h下降較明顯，其在小葉中央靜脈及匯管區(qū)的表達(dá)明顯較肝實(shí)質(zhì)內(nèi)致密，陽性表達(dá)至12h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，24h時(shí)

9、開始回升。Caspase-3在正常組及假手術(shù)組各時(shí)限點(diǎn)無顯著性差異(P>0.05)，而在損傷組缺血后再灌注0h表達(dá)即開始增強(qiáng)，在再灌注24h組表達(dá)水平達(dá)峰值，至72h后回復(fù)到基線水平(P>0.05)。肝缺血再灌注后外周血清ALT、AST濃度升高，再灌注0h、3h、12h、24h損傷組較同期正常組及假手術(shù)組高(P<0.01)，24h時(shí)濃度開始下降，至72h時(shí)恢復(fù)正常。光鏡下?lián)p傷組再灌注0h時(shí)細(xì)胞僅輕度水腫，3h肝細(xì)胞失去原有正常形態(tài)，肝細(xì)

10、胞水腫，細(xì)胞質(zhì)降解，核仁縮小、凝集；12h～24h肝細(xì)胞進(jìn)一步水腫，細(xì)胞質(zhì)降解明顯，肝血竇嚴(yán)重變窄，肝細(xì)胞索排列紊亂。72h肝細(xì)胞水腫變輕，可見少量新生肝細(xì)胞，肝血竇狹窄程度減輕。電鏡下正常對(duì)照組及假手術(shù)組超微結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常，損傷組再灌注3h大部分細(xì)胞濃密，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞肝竇微絨毛致密，核染色質(zhì)濃縮、邊集；12h～24h肝細(xì)胞進(jìn)一步濃密，胞質(zhì)呈均質(zhì)狀，核膜消失；72h時(shí)大部分細(xì)胞形態(tài)基本正常。 小結(jié)： IGF-I可

11、以作為肝臟缺血再灌注時(shí)反映肝功能的指標(biāo)之一；其時(shí)空分布特點(diǎn)為：損傷組再灌注0h～24h期間IGF-I表達(dá)持續(xù)下降，以0h～3h下降較明顯，12h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，24h時(shí)開始回升，且在小葉中央靜脈及匯管區(qū)的表達(dá)較肝實(shí)質(zhì)內(nèi)致密；IGF-I作為一種內(nèi)源性保護(hù)因子，可能在一定程度上減輕肝缺血再灌注損傷所造成的肝功能損害。 目的：建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷未處理組、假手術(shù)組、正常組及丹參預(yù)處理組，觀察丹參預(yù)處理組和未處理組IGF-I、Cas

12、pase-3表達(dá)特點(diǎn)，血清酶ALT、AST水平以及肝臟病理形態(tài)學(xué)變化，探討丹參在肝臟缺血再灌注不同時(shí)限對(duì)IGF-I表達(dá)的影響及意義。 方法： 1.健康純系SD大鼠100只，隨機(jī)分4組，正常對(duì)照組(n=25只)，假手術(shù)組(n=25只)，未處理組(n=25只)，丹參組(n=25只)，各組內(nèi)又根據(jù)再灌注后不同時(shí)間(0h、3h、12h、24h、72h)分為5小組，每組5只。 2.術(shù)前禁食12小時(shí)，自由飲水。麻醉生效后，常

13、規(guī)備皮、消毒，取上腹正中切口長約3cm，正常對(duì)照組開腹后直接取材，假手術(shù)組開腹后僅解剖肝門，缺血再灌注組在肝十二指腸韌帶遠(yuǎn)心端安置無損傷動(dòng)脈鉗鉗夾肝蒂45分鐘，于不同復(fù)流時(shí)間(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝組織制備免疫組化及光鏡觀察標(biāo)本，肝上下腔靜脈取血測(cè)定生化指標(biāo)。丹參預(yù)處理組斷流前30分鐘經(jīng)尾靜脈推注丹參注射液6g/kg加生理鹽水40ml/kg。 3.IGF-I及Caspase-3免疫組化檢測(cè)依說明書進(jìn)行。IGF

14、-I以及Caspase-3陽性細(xì)胞判定方法為胞漿呈胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT和AST水平。采用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織細(xì)胞及細(xì)胞器病理形態(tài)學(xué)變化。 4.用SPSS13.0進(jìn)行分析。采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較用單因素方差分析，多重比較用LSD法。P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。 結(jié)果： 正常

15、對(duì)照組與假手術(shù)組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)無明顯差異。未處理組與丹參組在再灌注3h時(shí)IGF-I表達(dá)較正常對(duì)照組及假手術(shù)組均下降，12h時(shí)達(dá)到最低，24h時(shí)開始恢復(fù)，但丹參組下降程度較未處理組??；丹參組Caspase-3在0h、3h、12h、時(shí)與正常對(duì)照組及假手術(shù)組相比表達(dá)水平升高，但水平較未處理組低(P>0.05)，在24h及72h與未處理組無顯著性差異(P>0.05)。光鏡下再灌注0h時(shí)丹參組及未處理組細(xì)胞僅輕度水腫，其余無明顯改變；3h起丹參組肝

16、細(xì)胞輕、中度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，少數(shù)細(xì)胞脂肪變性，組織結(jié)構(gòu)尚清晰，未處理組肝細(xì)胞明顯腫脹，胞質(zhì)內(nèi)重度空泡樣變性和脂肪變，部分細(xì)胞質(zhì)降解，核仁縮小，凝集，肝竇內(nèi)腔隙變窄；丹參組12h～24h肝細(xì)胞水腫略有加重，局部有點(diǎn)狀壞死，但肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列尚規(guī)整；未處理組細(xì)胞質(zhì)降解明顯，肝血竇嚴(yán)重變窄，肝細(xì)胞索排列紊亂。72h時(shí)兩組光鏡下表現(xiàn)基本相同，肝細(xì)胞水腫變輕，可見少量新生肝細(xì)胞，肝血竇狹窄減輕。未處理組3h～12h外周血清ALT、AST濃度升

17、高，24h時(shí)濃度開始下降，至72h時(shí)恢復(fù)正常。丹參組3h～12hALT、AST也升高，24h時(shí)開始下降，此三組較同時(shí)間對(duì)照組升高程度低(P<0.05)，72h時(shí)恢復(fù)正常，與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。 小結(jié)： 研究結(jié)果表明，肝缺血45min再灌注不同時(shí)限，丹參組IGF-I表達(dá)強(qiáng)于未處理組，肝細(xì)胞損傷相對(duì)較輕，肝臟功能相對(duì)較好，其原因可能為，丹參通過促進(jìn)微循環(huán)，抑制細(xì)胞損傷和死亡，改善細(xì)胞內(nèi)的缺氧環(huán)境，促進(jìn)肝細(xì)胞合