丹參對肝臟缺血再灌注不同時限胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）表達的影響.pdf

1、研究背景： 在肝外傷、肝切除、肝移植以及多器官功能衰竭救治領域中，肝臟缺血再灌注損傷是造成肝功能損害的重要因素，其損傷機理及臟器保護研究始終是肝臟外科、創(chuàng)傷外科，移植外科的重要方向。缺血再灌注損傷是一個受多因素調節(jié)和影響的過程。復氧過程中活性氧的產生，Kupffer細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的活化，引起一系列損害性的細胞反應，繼而導致炎性反應和細胞凋亡。同時，由于肝竇內皮細胞的損害，產生微循環(huán)障礙，進一步加重了肝臟的局部缺血。在

2、缺血再灌注過程中，許多細胞因子和激素的表達水平都發(fā)生了改變，并在其中發(fā)揮不同的作用，如一氧化氮(NO)、熱休克蛋白(HSP)、內皮素(ET)、缺氧誘導因子-I(HIF-I)、胰島素樣生長因子-I等。其中，胰島素樣生長因子(insulin-likegrowthfactor，IGF)的作用得到了越來越多的重視。IGF是一類既有胰島素樣合成代謝作用，又有促生長作用的多肽，它們在機體組織細胞的增殖、分化和轉化及抑制細胞凋亡中起重要作用，是許多組

3、織生長和分化的重要調節(jié)因子，它還對不同的代謝產物、糖和氨基酸轉運過程起胰島素樣作用。近年來，IGF-I在肝外傷、肝臟手術以及多器官功能衰竭中的異常表達開始引起人們的關注，而關于IGF-I與肝臟缺血再灌注損傷的關系，它在肝臟缺血再灌注期表達的時空分布特點及其作用意義，尚未能最后闡明。 丹參為我國傳統(tǒng)活血祛瘀中藥，已有諸多研究表明丹參對重要臟器組織缺血再灌注損傷有較好的保護作用，這一原理主要為兩方面，其一是改善微循環(huán)灌注不足及抗氧自

4、由基作用，其二是可以降低肝細胞內的游離鈣離子濃度，減輕由于鈣超載引起的細胞損傷。而丹參的這些對肝臟的保護作用與IGF-I是否有一定內在聯系，還無人知曉。 本課題在以往前期研究工作基礎上進一步進行肝缺血再灌注期IGF-I表達的研究，整體實驗工作分為兩部分：第一部分通過建立大鼠肝臟缺血再灌注模型，觀察肝缺血再灌注不同時限中IGF-I及Caspase-3的表達特點，了解肝臟缺血再灌注IGF-I與肝臟功能及細胞凋亡的關系，探討其時空表達

5、特點及作用意義。第二部分通過對比分析丹參預處理組與未處理組IGF-I、Caspase-3表達的不同特點，研究丹參對肝臟缺血再灌注損傷不同時限胰島素樣生長因子-I表達的影響及意義。研究工作的目的旨在了解肝臟缺血再灌注期IGF-I表達的時空特點及作用意義，以及國藥丹參對肝臟缺血再灌注時IGF-I表達的影響，從而為肝缺血再灌注損傷的防治探索新的方向。 目的： 建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，觀察肝缺血再灌注不同時限中IGF-I

6、及Caspase-3的表達特點并了解IGF-I在肝缺血再灌注損傷時的時空分布特點及作用意義。 方法： 1.健康純系SD大鼠75只隨機分為3組，正常組(n=25只)，假手術組(n=25只)及缺血再灌注組(n=25只)，各組內又根據再灌注后不同時間(0h、3h、12h、24h、72h)分為5個亞組，每組5只。 2.術前禁食12h，自由飲水。腹腔麻醉生效后，常規(guī)備皮、消毒，正常組進腹后直接切取肝組織待測，假手術組僅解剖

7、肝門；缺血再灌注組在肝十二指腸韌帶遠心端安置無損傷動脈鉗鉗夾肝蒂45min，于不同復流時間(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝組織制備免疫組化及光鏡、電鏡觀察標本，肝上下腔靜脈取血測定生化指標。 3.IGF-I及Caspase-3免疫組化檢測依說明書進行。胞漿呈胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性反應。每張切片在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野統(tǒng)計100個細胞中的陽性細胞數。血清ALT和AST采用全自動生化分析儀檢測

8、。用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察肝組織細胞及細胞器病理形態(tài)學變化。 4.用SPSS13.0進行分析。采用重復測量方差分析，組間比較用單因素方差分析，多重比較用LSD法。P<0.05認為差異有顯著性。 結果： 正常組及假手術組各時限點IGF-I表達無顯著性差異(P>0.05)。損傷組再灌注0h時IGF-I表達下降，3h下降較明顯，其在小葉中央靜脈及匯管區(qū)的表達明顯較肝實質內致密，陽性表達至12h時達到最低點，24h時

9、開始回升。Caspase-3在正常組及假手術組各時限點無顯著性差異(P>0.05)，而在損傷組缺血后再灌注0h表達即開始增強，在再灌注24h組表達水平達峰值，至72h后回復到基線水平(P>0.05)。肝缺血再灌注后外周血清ALT、AST濃度升高，再灌注0h、3h、12h、24h損傷組較同期正常組及假手術組高(P<0.01)，24h時濃度開始下降，至72h時恢復正常。光鏡下損傷組再灌注0h時細胞僅輕度水腫，3h肝細胞失去原有正常形態(tài)，肝細

10、胞水腫，細胞質降解，核仁縮小、凝集；12h～24h肝細胞進一步水腫，細胞質降解明顯，肝血竇嚴重變窄，肝細胞索排列紊亂。72h肝細胞水腫變輕，可見少量新生肝細胞，肝血竇狹窄程度減輕。電鏡下正常對照組及假手術組超微結構形態(tài)基本正常，損傷組再灌注3h大部分細胞濃密，細胞間隙增大，細胞肝竇微絨毛致密，核染色質濃縮、邊集；12h～24h肝細胞進一步濃密，胞質呈均質狀，核膜消失；72h時大部分細胞形態(tài)基本正常。 小結： IGF-I可

11、以作為肝臟缺血再灌注時反映肝功能的指標之一；其時空分布特點為：損傷組再灌注0h～24h期間IGF-I表達持續(xù)下降，以0h～3h下降較明顯，12h時達到最低點，24h時開始回升，且在小葉中央靜脈及匯管區(qū)的表達較肝實質內致密；IGF-I作為一種內源性保護因子，可能在一定程度上減輕肝缺血再灌注損傷所造成的肝功能損害。 目的：建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷未處理組、假手術組、正常組及丹參預處理組，觀察丹參預處理組和未處理組IGF-I、Cas

12、pase-3表達特點，血清酶ALT、AST水平以及肝臟病理形態(tài)學變化，探討丹參在肝臟缺血再灌注不同時限對IGF-I表達的影響及意義。 方法： 1.健康純系SD大鼠100只，隨機分4組，正常對照組(n=25只)，假手術組(n=25只)，未處理組(n=25只)，丹參組(n=25只)，各組內又根據再灌注后不同時間(0h、3h、12h、24h、72h)分為5小組，每組5只。 2.術前禁食12小時，自由飲水。麻醉生效后，常

13、規(guī)備皮、消毒，取上腹正中切口長約3cm，正常對照組開腹后直接取材，假手術組開腹后僅解剖肝門，缺血再灌注組在肝十二指腸韌帶遠心端安置無損傷動脈鉗鉗夾肝蒂45分鐘，于不同復流時間(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝組織制備免疫組化及光鏡觀察標本，肝上下腔靜脈取血測定生化指標。丹參預處理組斷流前30分鐘經尾靜脈推注丹參注射液6g/kg加生理鹽水40ml/kg。 3.IGF-I及Caspase-3免疫組化檢測依說明書進行。IGF

14、-I以及Caspase-3陽性細胞判定方法為胞漿呈胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性反應。每張切片在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野統(tǒng)計100個細胞中的陽性細胞數。采用全自動生化分析儀檢測血清ALT和AST水平。采用光學顯微鏡觀察肝組織細胞及細胞器病理形態(tài)學變化。 4.用SPSS13.0進行分析。采用重復測量方差分析，組間比較用單因素方差分析，多重比較用LSD法。P<0.05認為差異有顯著性。 結果： 正常

15、對照組與假手術組各項檢測指標無明顯差異。未處理組與丹參組在再灌注3h時IGF-I表達較正常對照組及假手術組均下降，12h時達到最低，24h時開始恢復，但丹參組下降程度較未處理組小；丹參組Caspase-3在0h、3h、12h、時與正常對照組及假手術組相比表達水平升高，但水平較未處理組低(P>0.05)，在24h及72h與未處理組無顯著性差異(P>0.05)。光鏡下再灌注0h時丹參組及未處理組細胞僅輕度水腫，其余無明顯改變；3h起丹參組肝

16、細胞輕、中度水腫，少量炎細胞浸潤，少數細胞脂肪變性，組織結構尚清晰，未處理組肝細胞明顯腫脹，胞質內重度空泡樣變性和脂肪變，部分細胞質降解，核仁縮小，凝集，肝竇內腔隙變窄；丹參組12h～24h肝細胞水腫略有加重，局部有點狀壞死，但肝細胞結構排列尚規(guī)整；未處理組細胞質降解明顯，肝血竇嚴重變窄，肝細胞索排列紊亂。72h時兩組光鏡下表現基本相同，肝細胞水腫變輕，可見少量新生肝細胞，肝血竇狹窄減輕。未處理組3h～12h外周血清ALT、AST濃度升

17、高，24h時濃度開始下降，至72h時恢復正常。丹參組3h～12hALT、AST也升高，24h時開始下降，此三組較同時間對照組升高程度低(P<0.05)，72h時恢復正常，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。 小結： 研究結果表明，肝缺血45min再灌注不同時限，丹參組IGF-I表達強于未處理組，肝細胞損傷相對較輕，肝臟功能相對較好，其原因可能為，丹參通過促進微循環(huán)，抑制細胞損傷和死亡，改善細胞內的缺氧環(huán)境，促進肝細胞合