鯉胰島素樣生長(zhǎng)因子的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、本研究在克隆鯉，IGF-ⅠⅡ和IGF-Ⅱ的基礎(chǔ)上，運(yùn)用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)鯉IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的基因工程表達(dá)進(jìn)行了研究。 1.運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，從鯉肝臟總RNA中擴(kuò)增出IGF-Ⅰ成熟肽cDNA序列，IGF-Ⅱ前肽cDNA序列，連接至pMD18-T載體，測(cè)序結(jié)果表明，與已報(bào)道的序列相比，克隆的鯉IGF-Ⅰ與其完全相同，IGF-Ⅱ基因有1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生同義突變。 2.構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-KG

2、-IGF-Im和pET-32a-IGF-Ⅱm，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析，重組菌可表達(dá)分子量分別約為34kDa和28kDa的重組蛋白，且目的蛋白主要以包涵體的形式存在，經(jīng)0.3mmol/LIPTG誘導(dǎo)3h后，表達(dá)量均出現(xiàn)最高，占菌體總量的30％～35％。提取包涵體，并進(jìn)行SKL變性及透析復(fù)性處理，由此初步純化了原核重組蛋白IGFs。 3.以初步純化的原核重組蛋白IGF-Ⅰ和IGF

3、-Ⅱ?yàn)榭乖?，分別免疫新西蘭大耳兔，制備了兔抗鯉IGF-Ⅰ/IGF-Ⅱ抗血清?？寡褰?jīng)間接ELISA檢測(cè)效價(jià)結(jié)果，Western-blot顯示抗血清均能與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。 4.構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPIC9K-IGF-Ⅰm，LiCl法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌。經(jīng)表型分析、G418篩選及PCR鑒定，得到His<'+>Mut<'+>型抗2.0 mg/mLG418的多拷貝轉(zhuǎn)化子。以0.5％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，Dot-Blot及Tricine-