非洲豬瘟p54蛋白的表達(dá)及ELISA抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、StudiesontheExpressionofAfricanSwineFeverVirusp54ProteinandEstablishment0fELISAforDetectionofAntibodies’’、’‘submittedt01heslssubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgro

2、nomy1●一一WangLiping(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfQinXiaobingervlsor：ShanHuGongZhenhuaQingdaoChinaJune，2014壹魚盤些太堂亟堂僮途窒摘噩非洲豬瘟p54蛋白的表達(dá)及ELISA抗體檢測(cè)方法的建立摘要非洲豬瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African

3、swinefevervirus，ASFV)弓l起的豬的一種急性、熱性傳染病，該病發(fā)病率高，死亡率從5％到100％不等，世界衛(wèi)生組織將其列為必須要報(bào)告的動(dòng)物疫病之一。自1921年ASF在肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)以來，目前已在非洲、歐洲和美洲等約49個(gè)國(guó)家報(bào)道發(fā)生過ASF疫情。2007年，與我國(guó)接壤的俄羅斯爆發(fā)ASF，目前陸續(xù)有14個(gè)州爆發(fā)過ASF，若繼續(xù)蔓延，我國(guó)不排除傳入ASF的可能。ASF的蔓延速度非?？欤瑑H最近1年，就有包括白俄羅斯、烏克蘭、

4、立陶宛在內(nèi)的三個(gè)國(guó)家首次發(fā)現(xiàn)ASF。目前，各國(guó)都在建立ASFV的快速檢測(cè)和監(jiān)測(cè)方法以控制ASF的侵入，由于我國(guó)目前尚未發(fā)現(xiàn)此病，而且國(guó)內(nèi)禁止引進(jìn)外來病毒，從國(guó)外引進(jìn)血清又昂貴復(fù)雜，導(dǎo)致我國(guó)在此病的檢測(cè)方法上明顯落后于一些發(fā)達(dá)國(guó)家。因此，利用重組ASFV抗原建立快速、安全的診斷方法，以進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備是十分必要的，對(duì)防止ASF傳入我國(guó)具有重要意義。本研究旨在原核表達(dá)非洲豬瘟病毒(ASFV)p54蛋白，并進(jìn)一步建立p54間接ELISA方法，用于

5、ASFV的診斷。1參考非洲豬瘟病毒Con09／Bzz020株p54基因(E183L)的核苷酸序列，通過序列優(yōu)化后合成p54基因，克隆至表達(dá)載體pET30c()，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30c()一p54。結(jié)果顯示，pET30c()p54有完整的閱讀框架，可表達(dá)分子量約21kDa的p54蛋白，該蛋白表達(dá)穩(wěn)定，具有可溶性，易于純化，純度為95％，濃度高達(dá)800tg／mL，所表達(dá)的p54蛋白的氨基酸序列與Con09／Bzz020株p54蛋白氨基酸序

6、列相同；Western—blot試驗(yàn)顯示，表達(dá)的p54蛋白能與ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。研究結(jié)果證實(shí)p54蛋白表達(dá)產(chǎn)量高，易于純化，具有較好的抗原性，可用于非洲豬瘟ELISA診斷。2利用純化的p54重組融合蛋白作為抗原，進(jìn)行p54抗體檢測(cè)間接ELISA方法的建立。對(duì)ELISA反應(yīng)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定抗原p54的包被濃度為12599／mL；血清稀釋度為1：50；最佳包被條件為37“Clh4。C過夜；最適封閉液為5％的脫脂奶粉；