幾種單堿基突變檢測方法的建立及DNA池用于人群篩查的初步研究.pdf

1、目的：利用突變敏感性納米級復(fù)合分子開關(guān)建立幾種單堿基突變檢測新方法及結(jié)合DNA池用于人群篩查。 方法：以300例健康自愿獻(xiàn)血者為研究對象，肘正中靜脈采血5ml，加EDTA抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎梅?氯仿法提取基因組DNA和線粒體DNA，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，蛋白核酸定量測定儀測定DNA濃度，分管保存?zhèn)溆?。DNA池的基本單位由30個不同個體DNA所構(gòu)成。根據(jù)所選取的3個Y染色體基因組SNP、1個X染色體基因單堿基突變序列，2

2、個線粒體DNA基因單堿基突變序列，1對X、Y染色體特異性性別檢測位點，設(shè)計其突變分析引物。為了獲得比天然模板更高濃度的人工模板，以單一個體男性與女性血標(biāo)本抽提的DNA為天然模板，以匹配引物擴(kuò)增一輪PCR，突變引物擴(kuò)增兩輪PCR。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度計算模板拷貝數(shù)，再將人工突變模板和正常模板分別以突變引物擴(kuò)增，電泳鑒定，做Real-Time PCR，模板倍比稀釋檢測敏感性和特異性。用所建立的突變檢測方法，對300例正常人DNA池進(jìn)行男女性別

3、比例，和有無所選突變及突變在正常人群中的頻率估算。 結(jié)果：Y染色體上三個SNP位點經(jīng)普通PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果顯示復(fù)合分子開關(guān)具有良好的敏感性和特異性。經(jīng)Real-Time PCR結(jié)果顯示，其Ct值相差3-5個循環(huán)，表明突變敏感性納米級復(fù)合分子開關(guān)具有良好的實用價值。根據(jù)線粒體和X染色體基因的單堿基突變序列設(shè)計的引物，經(jīng)普通PCR擴(kuò)增后電泳鑒定，結(jié)果顯示具有良好的敏感性和特異性，Real-Time PCR結(jié)果顯示突變引物和匹配引

4、物的Ct值相差3個循環(huán)，同時敏感性和特異性試驗結(jié)果均有意義，可用于篩查突變率大于5％的特定突變。最后，通過對X、Y染色體特異性性別檢測位點的定量分析，結(jié)合DNA池，計算300份混合DNA標(biāo)本中的男女性別比例。 結(jié)論：通過對Y染色體SNP、X染色體基因單堿基突變序列、線粒體DNA基因單堿基突變序列以及x、Y染色體特異性性別檢測位點研究結(jié)果表明，將高保真酶的外切酶特性與耐外切酶消化的堿基特異性引物相結(jié)合的堿基敏感性復(fù)合分子“開/關(guān)”