新型單堿基突變檢測的壓電方法以及納米微囊探針的制備.pdf

1、當(dāng)前由于人們要揭開疾病的遺傳機理以及提高醫(yī)療診斷和測試技術(shù)，對特定序列的DNA的分析檢測變的越來越重要，DNA序列檢測成為近幾年來發(fā)展起來的基因診斷的基礎(chǔ)。單堿基多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）是遺傳變異中最豐富的形式，大約每100-300個堿基就有一個堿基可能發(fā)生突變。許多病原性和遺傳性疾病都是和正常基因DNA序列的改變相關(guān)的，因此對這些單堿基突變的確認(rèn)就能夠?qū)崿F(xiàn)對相關(guān)疾病的醫(yī)學(xué)診斷。

2、實現(xiàn)對這些基因單堿基突變的早期、準(zhǔn)確、簡便、快速的確認(rèn)，對于人類相關(guān)疾病的發(fā)病機理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前，對于單鏈核苷酸以及單堿基突變的檢測方法有很多種。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費時、不易定量、儀器昂貴、且對工作人員要求較高的專業(yè)技能，因此僅能在少數(shù)實驗室應(yīng)用。開發(fā)一些簡便、價廉、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價值的工作，而就最近的研究表明由于壓電DNA生物傳感器具有操作簡便，響應(yīng)迅速，靈敏度較高，價格低廉等特點

3、，已經(jīng)成為進行核酸的結(jié)構(gòu)分析和單堿基突變檢測的重要手段，在本研究論文中，主要基于壓電石英晶振表面的質(zhì)量效應(yīng)，DNA連接酶反應(yīng)和納米顆粒放大效應(yīng)來實現(xiàn)DNA目標(biāo)鏈中的單堿基突變檢測，主要內(nèi)容如下： 利用核酸標(biāo)記金納米顆粒，提出了一種基于DNA連接酶反應(yīng)和納米金放大效應(yīng)的壓電檢測方法，用于單堿基突變的檢測（第2章）。首先將巰基修飾的DNA捕獲探針固定在壓電石英晶振金電極表面；然后加入目標(biāo)鏈和金標(biāo)DNA探針，形成DNA雙鏈；經(jīng)連接酶連

4、接后加熱解鏈，當(dāng)目標(biāo)鏈和探針序列中有單堿基錯配時，所形成的DNA雙鏈解鏈，晶振頻率將回復(fù)到固定捕獲探針時的數(shù)值，而目標(biāo)鏈和兩探針完全匹配時，則不發(fā)生解鏈，晶振頻率將不會回復(fù)到初始值,從而可以達到區(qū)分基因點突變的目的。該方法已成功的應(yīng)用于人工合成的β－地中海貧血基因密碼子17（CD17）的單堿基突變的檢測。與傳統(tǒng)的方法相比，該方法操作簡便，快速，最小檢出值可以達到2.6 pmol/L,為基因突變疾病的臨床診斷提供了一種新手段。此后，我們又

5、將這一檢測體系的傳感器的再生及DNA鏈的純化進行了改善（第3章）。簡言之，5’端標(biāo)記有生物素的捕獲探針和3’端修飾有Fe3O4/Au磁性納米顆粒的檢測探針與目標(biāo)鏈進行雜交，形成DNA雙鏈，經(jīng)過酶連后加熱解鏈，當(dāng)目標(biāo)鏈和探針有單堿基錯配時，兩探針之間以及探針與目標(biāo)鏈解離,而對于完全匹配的目標(biāo)鏈，兩個探針不會解離，而當(dāng)解鏈后的DNA鏈與壓電石英晶振表面固定的BSA－脫硫生物素－親和素反應(yīng)，由于完全匹配的兩探針沒有解離，則捕獲探針5’端標(biāo)記有

6、的生物素可以和金電極的親和素反應(yīng)，引起電極表面質(zhì)量變化，從而引起頻率的降低，而對于不完全匹配目標(biāo)鏈，晶振表面頻率幾乎沒有變化，使用該方法，對b地中海貧血基因的-28位點突變的情況（這種突變是中國西南省份發(fā)病率最高的四種突變中的一種）成功地進行了檢測。 分子信標(biāo)技術(shù)，由于其非標(biāo)記、靈敏且具有較高的選擇性等特點，已被證明是一種非常有用的核酸檢測方法。在第4章，我們發(fā)展了一種新的、基于分子信標(biāo)識體變構(gòu)控制的電化學(xué)通道法，用于DNA雜交

7、反應(yīng)的檢測。該方法靈敏、特異性好、無需標(biāo)記，并且可以很好地用于單堿基錯配的區(qū)分。首先，將標(biāo)記有生物素（作為質(zhì)量放大信號分子）的分子信標(biāo)識體固定于壓電石英晶振的金電極表面，然后用巰基11酸封閉電極，形成分子印跡發(fā)夾結(jié)構(gòu)。對于完全匹配的目標(biāo)鏈，當(dāng)雜交反應(yīng)發(fā)生時，發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)被破壞，形成配基鍵合的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，生物素遠離電極表面，當(dāng)與親和素反應(yīng)時，引起傳感器表面質(zhì)量顯著變化，頻率降低。而對于有單堿基突變的目標(biāo)鏈，則發(fā)夾結(jié)構(gòu)不會打開，不能形成D

8、NA雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入親和素，由于環(huán)形探針的空間阻礙作用，生物素不會與親和素發(fā)生作用，電極表面的質(zhì)量變化不明顯，從而頻率也沒有明顯的下降。使用該方法對包含第142位密碼子的α-地中海貧血基因片斷進行了分析，濃度檢測動態(tài)線性范圍為1.41×10-11-1.41×10-7M，檢測下限可達10-11M。 此外，我們使用大豆磷脂包被半胱氨酸，制備了一種可控制釋放的脂質(zhì)體微囊探針。在免疫分析中，通過包入的半胱氨酸的釋放，實現(xiàn)被分析物的高靈敏