表達(dá)HBX的人正常肝細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞系的建立.pdf

1、目的:通過(guò)構(gòu)建HBX的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-X，并將其轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞HL-7702和肝腫瘤細(xì)胞HepG2，構(gòu)建表達(dá)HBX的HL-7702/HBX和HepG2/HBX細(xì)胞模型，為進(jìn)一步探討HBX在HBV感染和HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用搭建新的研究平臺(tái)，為HBV感染的治療和相關(guān)肝癌疫苗的設(shè)計(jì)提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:通過(guò)設(shè)計(jì)HBX的特異性引物，應(yīng)用RT-PCR的方法從HepG 2.2.15細(xì)胞中獲取HBXcDNA，將其導(dǎo)入

2、真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，通過(guò)PCR、雙酶切鑒定后，選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。將構(gòu)建成功的HBX真核表達(dá)載體pcDNA3.1-X用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，G418篩選陽(yáng)性克隆。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)HBXmRNA表達(dá)情況；通過(guò)Western blot和免疫熒光檢測(cè)HBx蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:重組質(zhì)粒通過(guò)PCR、雙酶切后電泳顯示存在與目的

3、基因大小相同的條帶，DNA測(cè)序結(jié)果顯示與Genebank公布的HBX基因序列一致。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，RT-PCR鑒定顯示，只有轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-X的HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞有HBXmRNA表達(dá)；Western blot和免疫熒光檢測(cè)顯示，僅轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-x的HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞有HBx蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 1．HBX真核表達(dá)載體pcDNA3.1-X構(gòu)建成功。 2．成功建立HBX