冬青素A抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤藥理研究.pdf

1、目的：
　　癌癥是危害人類生命健康的嚴(yán)重疾病且發(fā)病率逐年攀升，尋找惡性腫瘤有效的防治方法迫在眉睫。化學(xué)治療藥物是當(dāng)今腫瘤治療的主要措施之一，但化療藥物在殺傷靶細(xì)胞時(shí)往往累及正常細(xì)胞，如抑制機(jī)體免疫功能、損傷骨髓造血機(jī)能、損害消化道等重要臟器。嚴(yán)重的毒副作用及癌細(xì)胞產(chǎn)生的多藥耐藥，由治療產(chǎn)生的昂貴費(fèi)用迫使化療藥物使用受限。近幾十年來中藥及其化學(xué)成分以多靶點(diǎn)、低毒性、來源豐富等特點(diǎn)在腫瘤發(fā)生的多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用;同時(shí)多種中藥具有增強(qiáng)機(jī)體免

2、疫功能且不易產(chǎn)生耐藥性而成為抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。
　　冬青素A(Ilexgenin A，IA)提自冬青科冬青屬植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)葉（又名山綠茶葉）的有效成分。山綠茶為我國傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒，活血通脈之功效。本課題旨在探討IA是否具有抗腫瘤作用并初步評價(jià)其安全性，進(jìn)而為明確其抗腫瘤作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分:體外培養(yǎng)B16-F10小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞

3、，采用MTT法檢測IA對B16-F10細(xì)胞的增殖抑制率，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50，μM)。同時(shí)檢測B16-F10細(xì)胞周期分布，探明IA對B16-F10細(xì)胞周期的作用時(shí)限。
　　第二部分:將B16-F10細(xì)胞接種于C57BL/6J小鼠右側(cè)腋窩皮下建立B16-F10惡性黑色素瘤移植瘤模型，并隨機(jī)分為模型組、IA15 mg/kg組、IA30 mg/kg組與陽性對照紫杉醇45mg/kg組。分別按上述劑量灌胃給予受試藥，模型組灌胃等量溶

4、媒（0.5％羧甲基纖維素鈉），陽性對照組腹腔注射紫杉醇，每周2次;每天觀察小鼠狀況并稱算進(jìn)食量;每2天稱體重;連續(xù)干預(yù)10天，剝?nèi)×鼋M織，稱量瘤重計(jì)算抑瘤率(％)，觀察IA對移植瘤增殖的抑制作用。取小鼠胸腺、脾臟、心臟、肝臟、肺臟與腎臟稱重，計(jì)算各重要臟器系數(shù)并進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢查，觀察有無病理改變。
　　第三部分:在結(jié)束荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)，取血分離血清，ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α及IL-12/IL-23p40。同時(shí)體外制

5、備惡性黑色素瘤條件培養(yǎng)基(20％ v/v)與RAW264.7鼠源巨噬細(xì)胞共培養(yǎng);加入IA干預(yù)6h或12h后，離心取上清ELISA法檢測IL-6水平。另將惡性黑色素瘤條件培養(yǎng)基(100％ v/v)與RAW264.7鼠源巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化;加入IA干預(yù)24 h后，提取RNA并檢測Arg-1、IL-6、VEGF和p65 mRNA水平。
　　第四部分:將B16-F10細(xì)胞接種至C57BL/6J小鼠右側(cè)腋窩皮下建立B16-F1

6、0惡性黑色素瘤移植瘤模型，隨機(jī)分為模型組、IA30 mg/kg組和IA60 mg/kg組。分別按上述劑量灌胃給予受試藥，模型組灌胃等量溶媒（0.5％羧甲基纖維素鈉）;連續(xù)給藥30天停藥，繼續(xù)飼養(yǎng)至100天，觀察并記錄生存情況，繪制小鼠生存曲線并計(jì)算平均生存時(shí)間。
　　結(jié)果：
　　第一部分: IA可劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制B16-F10細(xì)胞增殖。24、48 h半數(shù)抑制濃度分別為27.34μM和12.44μM。細(xì)胞周期分析顯示

7、IA在20μM濃度時(shí)即可將B16-F10細(xì)胞阻滯在G1/S期(p＜0.05)。
　　第二部分:與模型組（平均瘤重10.01±3.14g）比較，IA30 mg/kg組平均瘤重為4.87±3.71g（抑瘤率:51.13％，p＜0.01）。IA15 mg/kg組與紫杉醇45 mg/kg組的平均瘤重分別為6.36±3.99 g（抑瘤率:36.45％，p＜0.05）和2.88±1.71 g（抑瘤率:71.25％，p＜0.001）。在給予IA

8、期間，B16-F10荷瘤小鼠未出現(xiàn)明顯毒副反應(yīng)。此外，組織形態(tài)學(xué)檢查未見重要臟器異常，亦未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　第三部分:與模型組比較，1A30 mg/kg可顯著抑制B16-F10荷瘤小鼠血清IL-6水平(p＜0.001)且可上調(diào)TNF-α水平(p＜0.01)。此外，惡性黑色素瘤條件培養(yǎng)基(20％v/v)誘導(dǎo)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞可顯著升高IL-6表達(dá)(p＜0.001)。而IA在5μM時(shí)即可下調(diào)IL-6水平(p＜0.001)。

9、在惡性黑色素瘤條件培養(yǎng)基(100％ v/v)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化的M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞模型中 Arg-1 mRNA表達(dá)水平顯著上升(p＜0.001)，IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著下降(p＜0.01)，VEGF mRNA表達(dá)水平顯著上升(p＜0.001)。冬青素A可劑量依賴性的升高IL-6水平，且在20μM即有顯著性差異(p＜0.05)。此外，冬青素A可顯著抑制由條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)水平(p＜0.001)及Arg-1表達(dá)水平(p＜

10、0.01)。對NF-κB亞基p65 mRNA檢測發(fā)現(xiàn):與對照組相比條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)p65 mRNA水平上調(diào)(p＜0.01)，而冬青素A可劑量依賴性抑制p65亞基mRNA表達(dá)水平(p＜0.01)。
　　第四部分:IA可顯著抑制B16-F10惡性黑色素瘤移植瘤小鼠腫瘤增殖。第30天受試藥干預(yù)結(jié)束，IA30 mg/kg及IA60 mg/kg組有6只小鼠未長出腫瘤塊。停藥后觀察期間IA30mg/kg與IA60 mg/kg組各有1只小鼠出現(xiàn)

11、腫瘤復(fù)發(fā)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束IA60 mg/kg組仍有4只小鼠存活(44.4％)，且未見出瘤跡象。與模型組平均生存時(shí)間27天比較，IA60 mg/kg組的平均生存時(shí)間達(dá)到79天，表明IA可顯著延長B16-F10荷瘤小鼠的生存期(p＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　(1)體外試驗(yàn)IA可顯著抑制B16-F10小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖，推測該作用與阻滯細(xì)胞周期在G1/S期相關(guān)。
　　(2)IA不僅抑制B16-F10荷瘤小鼠腫瘤增殖