亞硒酸鈉對延邊奶山羊乳腺上皮細胞過氧化氫所致氧化損傷的保護作用.pdf

1、目的：本實驗以延邊奶山羊的乳腺上皮細胞作為實驗材料，確定最合適體外培養(yǎng)延邊奶山羊乳腺上皮細胞的最佳條件，并探究延邊奶山羊乳腺上皮細胞在受到外源過氧化氫給予的氧化應激刺激后，加入一定量的亞硒酸鈉以發(fā)揮其對乳腺上皮細胞的保護作用，并確定亞硒酸鈉對乳腺上皮細胞的最佳保護濃度。
　　方法：（1）分別用組織塊培養(yǎng)法和Ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化法兩種方法建立延邊奶山羊乳腺上皮細胞，并對細胞進行純化，隨后對純化后的延邊奶山羊乳腺上皮細胞的骨架蛋

2、白—角蛋白的表達情況進行檢測；（2）用體外培養(yǎng)的延邊奶山羊乳腺上皮細胞傳代后進行實驗。過氧化氫用DMEM/F12培養(yǎng)基分別稀釋為5、50、100、200、500μM，以DMEM/F12培養(yǎng)基作為空白對照組。過氧化氫處理4 h后，用MTT法觀察過氧化氫對乳腺上皮細胞活力的影響，用Hoechst33342/PI熒光染色法觀察過氧化氫損傷對乳腺上皮細胞的凋亡情況，DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS含量；（3）將延邊奶山羊乳腺上皮細胞分為3組：正常

3、組（對照組1），過氧化氫損傷組（對照組2），亞硒酸鈉保護組。MTT方法檢測細胞活力，Hoechst33342/PI雙染、Giemsa染色法檢測細胞凋亡情況，DHE染色法檢測細胞內(nèi)ROS含量。
　　結果：（1）使用組織塊培養(yǎng)法5~8天后，才開始出現(xiàn)少量乳腺上皮細胞，呈多角形和卵圓形。而采用Ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化法消化收集細胞時，經(jīng)3h后，消化所得到的細胞則大多為乳腺上皮細胞。利用免疫熒光染色法，結果顯示，純化后分離培養(yǎng)的乳腺上皮

4、細胞角蛋白呈陽性表達，證明其具有腺泡上皮的特性；（2）MTT活性檢測結果表明，各處理組的細胞存活率與未處理組存在顯著差異（P＜0.05）。5、50、100μΜH2O2作用4 h后，細胞存活率分別為：91.21％、77.50%、54.48%，而200、500μΜH2O2作用4 h后細胞存活率僅為35.53%、27.79%，乳腺上皮細胞死亡過多。Hoechst33342/PI染色結果表明，H2O2通過誘導乳腺上皮細胞的凋亡及壞死來降低細胞的

5、存活率。利用熒光探針DCFH-DA分析DGMECs活性氧水平，結果顯示細胞經(jīng)H2O2處理后，會明顯增加細胞內(nèi)ROS水平；（3）較對照組2比，濃度為0.25、0.5、1.0μg/mL的亞硒酸鈉保護組的延邊奶山羊乳腺上皮細胞活力上升，細胞凋亡數(shù)目減少，ROS含量減少。其中以0.5μg/mL亞硒酸鈉處理組效果最顯著。說明0.5μg/mL的亞硒酸鈉可以減少過氧化氫所致的延邊奶山羊乳腺上皮細胞的氧化損傷，提高細胞活力，抑制細胞凋亡，減少細胞內(nèi)RO

6、S含量。
　　結論：（1）使用I型膠原酶及透明質(zhì)酸酶結合的消化法進行原代培養(yǎng)，得到的上皮型細胞純度相對較高，成纖維細胞混雜相對較少。經(jīng)過2~3代純化，即可得到純化后的延邊奶山羊乳腺上皮細胞；（2）用角蛋白單克隆抗體對體外培養(yǎng)獲得的細胞進行免疫熒光鑒定，結果呈陽性，證明了其腺泡上皮的特性；（3）H2O2的加入導致細胞活力下降，細胞出現(xiàn)凋亡甚至壞死，且細胞內(nèi)ROS含量上升。說明H2O2可以模擬體內(nèi)環(huán)境，作為乳腺上皮細胞氧化損傷模型的誘

7、導物質(zhì)；（4）100μmol/L H2O2作用于細胞4h，導致細胞50%左右死亡，壞死比例小，ROS含量也相對較少，在此濃度下，細胞還具有恢復其功能的可能性。故選擇100μmol/L H2O2作用于延邊奶山羊乳腺上皮細胞處理4 h，以建立氧化損傷模型。（5）0.5μg/mL SS能夠提高DGMECs抵制氧化應激的能力，從而減少細胞的氧化損傷程度，提高其細胞活力；（6）通過Hoechst33342/PI及Giemsa染色結果知，SS的加入