巨噬細胞和苯妥英鈉中介的旁分泌機制在心肌梗死后組織修復(fù)中的作用.pdf

1、心肌梗死后組織修復(fù)過程是影響心室重塑發(fā)展方向的決定因素。近年來的研究顯示，苯妥英鈉(PHT)可以通過介導(dǎo)旁分泌機制加速創(chuàng)傷修復(fù)，我們實驗室的前期工作證實苯妥英鈉可加速心肌梗死后組織修復(fù)，其可能機制是通過激活巨噬細胞，中介旁分泌機制。巨噬細胞在組織修復(fù)中是各種細胞因子和生長因子的重要來源。心肌梗死后早期移植巨噬細胞可促進血管新生、組織修復(fù)，改善心室重塑和心臟功能。然而苯妥英鈉通過激活巨噬細胞促進心肌梗死后組織修復(fù)的具體機制尚不十分清楚。

2、 目的：本實驗建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，并在梗死后早期進行同種異體腹腔巨噬細胞心肌內(nèi)移植，和PHT預(yù)刺激的腹腔巨噬細胞心肌內(nèi)移植，以及梗死后14天持續(xù)給予PHT腹腔內(nèi)注射，觀察上述干預(yù)因素對組織病理學(xué)、分子生物學(xué)和血流動力學(xué)的綜合影響，旨在探討巨噬細胞和PHT介導(dǎo)的旁分泌機制對心肌梗死后組織修復(fù)和心室重塑過程的影響并探討其可能機制。 方法：1．細胞實驗部分：進行Wistar大鼠腹腔巨噬細胞原代培養(yǎng)，并以苯妥英

3、鈉對部分體外培養(yǎng)的巨噬細胞進行預(yù)刺激(24h)，移植前用熒光染料DAPI標(biāo)記。 2．動物實驗部分：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，成活動物隨機分為假手術(shù)組(Sham組，12只)，對照組 (AMI組，23只)，苯妥英鈉組(PHT組，17只)，單純巨噬細胞移植組(Mφ組，20只)，以及經(jīng)苯妥英鈉預(yù)刺激的巨噬細胞移植組(Mφ-PHT組，16只)。Mφ組和Mφ-PHT組在再灌注同時，向左心室缺血區(qū)中心及周邊分別以1×10<'5>

4、細胞/只，100μL的劑量多點注射；AMI組和PHT組注射不完全DMEM培養(yǎng)基(100μL)；PHT組從術(shù)后第1天開始，連續(xù)14天經(jīng)腹腔注射PHT(75mg/kg/天)。術(shù)后第7天，各組分別隨機處死部分動物，留取心臟標(biāo)本，稱量雙側(cè)心室重量；通過苦味酸-天狼猩紅染色測定膠原容積分數(shù)(CVF)及膨展指數(shù)、梗死面積等，結(jié)合環(huán)形偏振光分析梗死區(qū)膠原成分比例；抗α-SMA免疫熒光染色測定梗死區(qū)小動脈密度；抗vWF免疫熒光染色測定梗死區(qū)毛細血管密度

5、；抗WGA免疫熒光染色測定非梗死區(qū)心肌細胞橫截面積(CSA)；梗死區(qū)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2) 蛋白表達水平采用Western blot分析。剩余動物于模型建立后第28天進行有創(chuàng)血流動力學(xué)分析，而后處死動物取心臟組織，進行組織病理學(xué)分析。 結(jié)果：1．細胞實驗部分：1)體外培養(yǎng)

6、的巨噬細胞貼壁牛長，培養(yǎng)的細胞群中無分裂相；苯妥英鈉刺激后的巨噬細胞仍貼壁良好，生長狀況穩(wěn)定；2)貼壁培養(yǎng)的細胞群中絕大多數(shù)細胞呈CD68 陽性。3) DAPI 標(biāo)記的巨噬細胞，經(jīng)紫外光激發(fā)后呈現(xiàn)大量圓形或不規(guī)則型的藍色熒光。 2．動物實驗部分：1)巨噬細胞移植成功的證據(jù)：術(shù)后1天心肌梗死區(qū)組織CD68免疫熒光染色顯示DAPI標(biāo)記的巨噬細胞表達CD68。2)術(shù)后第28天血流動力學(xué)結(jié)果：Mφ-PHT 組術(shù)后第 28 天LV+dp/

7、dt<,max>顯著高于AMI組；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第28天LV+dp/dt<,max>亦增高且具有統(tǒng)計學(xué)差異。3)心臟重量指標(biāo)比較：全心室體重比(V/BW)、左室體重比(LV/BW)、右室體重比(RV/BW)在各組間比較無顯著差異。4)左室重塑指標(biāo)結(jié)果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組和 Mφ-PHT 組術(shù)后第7天和第28天膨展指數(shù)均顯著減少且具有統(tǒng)計學(xué)差異；與AMI組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第28天梗死面積顯著減小；與

8、AMI組比較，PHT組術(shù)后7天和第28天梗死面積有減小趨勢；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后7天和第28天梗死面積有減小趨勢；與AMI組比較，Mφ組和Mφ-PHT 組術(shù)后7 天纖維面積顯著減小；與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT 組術(shù)后第28天纖維面積顯著減?。慌cMφ組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后第28天纖維面積顯著減??；與AMI組比較，Mφ組和 Mφ-PHT 組術(shù)后7天非梗死區(qū)CSA顯著減小，而PHT組術(shù)后7天非梗死區(qū)CS

9、A 有減小趨勢；與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT組術(shù)后第28天非梗死區(qū)CSA顯著減小。5) 膠原容積分數(shù)結(jié)果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組利Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天梗死區(qū)CVF顯著增加；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天梗死區(qū)CVF顯著增加；與AMI組比較，Mφ組和Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天非梗死區(qū)CVF顯著減少。6)膠原成分比例結(jié)果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第

10、28天梗死區(qū)膠原成熟度顯著增加；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后第7天和第28天梗死區(qū)膠原成熟度顯著增加。7)小動脈密度分析結(jié)果：與AMI組比較，PHT 組、Mφ組和Mφ-PHT 組術(shù)后第7天和第28天小動脈密度顯著增加：與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天小動脈密度有增加趨勢。8)毛細血管密度分析結(jié)果：與AMI 組比較，PHT組術(shù)后第7天和第28天毛細血管密度有增加趨勢；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天毛

11、細血管密度有增加趨勢。9)Westernblot 檢測結(jié)果：與AMI 組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后第7天梗死區(qū) b-FGF、MMP-2、TIMP-1和 TIMP-2 蛋白表達水平顯著增強；與AMI組比較，PHT組和Mφ組術(shù)后第7天梗死區(qū)MMP-2蛋白表達水平顯著降低；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天梗死區(qū) VEGF、b-FGF、MMP-2、TIMP-1和TlMP-2蛋白表達水平顯著增強：與Sham組比較，AMI組術(shù)后第7天梗死區(qū)M

12、MP-2/TIMP-2比值顯著增加。 結(jié)論：1．苯妥英鈉可能通過介導(dǎo)旁分泌機制，加速膠原沉積和成熟，并促進小動脈形成，加速組織修復(fù)過程，繼而改善心肌梗死后心室重塑；2．心肌梗死區(qū)巨噬細胞移植亦可通過上述機制加速組織修復(fù)、改善心肌梗死后心室重塑；3．苯妥英鈉預(yù)刺激的巨噬絀胞可以對心肌梗死后組織修復(fù)過程產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，可能機制為通過旁分泌效應(yīng)上調(diào)多種與組織修復(fù)密切相關(guān)的生長因子/關(guān)鍵酶系的蛋白表達水平，加速組織修復(fù)過程，且改善左