豬小腸粘膜下層作為組織工程肌腱支架的試驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】 本研究通過從雞胚屈趾肌腱提取的原代腱細(xì)胞，經(jīng)傳代擴(kuò)增后種植在經(jīng)過物理和化學(xué)方法處理后的SIS材料上，以SIS作為支架材料構(gòu)建組織工程肌腱。將其植入成年雞的屈趾肌腱缺損部位，比較組織工程肌腱與單純用SIS替代缺損肌腱之間是否存在差別。初步探討豬小腸粘膜下層作為組織工程肌腱支架的可行性。 【方法】 (1)取豬小腸的空腸部分，經(jīng)反復(fù)沖洗后，將其截成每段10cm?？v行剖開，用包裹紗布的刀柄刮去小腸的粘膜層，再翻

2、過來，刮去漿膜層和肌層，盡量刮除徹底。經(jīng)化學(xué)處理后，將小腸粘膜下層卷曲成軸，直徑為1.5～2.0mm，長度2.0cm，用11/0顯微縫合線在小腸粘膜下層的游離部分縫合3～4針固定，凍干后進(jìn)行真空包裝，然后進(jìn)行γ射線輻照。 (2)取15只19天的羅曼雞胚趾深屈肌腱，用酶消化方法體外分離培養(yǎng)肌腱細(xì)胞，并進(jìn)行傳代擴(kuò)增。 (3)對各代肌腱細(xì)胞的活性進(jìn)行比較。并選取第一代肌腱細(xì)胞進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn)，并利用所得結(jié)果繪制肌腱細(xì)胞生長曲

3、線。 (4)選取活性高的細(xì)胞以5×10<'6>/ml的密度種植在SIS上，體式顯微鏡下觀察細(xì)胞與材料粘附情況。 (5)將24只成年羅曼雞分成兩組，分別為復(fù)合細(xì)胞的SIS組(實(shí)驗(yàn)組)和無細(xì)胞的SIS組(對照組)，每組各12只，以雞左趾作為研究對象。用手術(shù)刀在雞中趾中、末節(jié)趾骨的屈側(cè)正中做切口，長約4cm，逐層切開皮膚、皮下組織、肌腱附屬組織，暴露趾深屈肌腱。盡量牽拉趾深屈肌腱，在其近端用細(xì)針頭固定，在距離固定處5mm部位切

4、斷該肌腱。將準(zhǔn)備好的SIS材料的一個(gè)末端與肌腱的近斷端以八字縫合、在兩端加固兩針。再測量2cm的長度，離斷趾深屈肌腱，將SIS的另一端與肌腱的遠(yuǎn)斷端縫合?？p合傷口，紗布包扎。跖趾關(guān)節(jié)背伸、趾間關(guān)節(jié)屈曲位石膏托固定。兩組動(dòng)物隔離散養(yǎng)，2周后拆除石膏托。 (6)分別于術(shù)后第3、6、9周作為時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只動(dòng)物(實(shí)驗(yàn)組和對照組各4只)，切取左趾移植物，進(jìn)行檢測。 (7)肉眼觀察材料。 (8)體式顯微鏡檢查。

5、 (9)石蠟切片、病理學(xué)檢查。 (10)于各時(shí)間點(diǎn)對標(biāo)本進(jìn)行力學(xué)測試，所得數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析。 【結(jié)果】 1．對原、傳代肌腱細(xì)胞培養(yǎng)和倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞在第2～3代細(xì)胞活性高，且外形規(guī)則，細(xì)胞分泌膠原的能力強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中我們選擇第二代細(xì)胞與材料復(fù)合。 2．MTT檢測結(jié)果顯示，肌腱細(xì)胞在第1和第2天生長迅速，到第3天后有所減緩，處于細(xì)胞增殖的平臺(tái)期，到第6天后細(xì)胞總數(shù)有下

6、降的趨勢。 3．體式顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，材料植入動(dòng)物體內(nèi)后降解速度很快，第3周SIS的60％已經(jīng)降解，第6周時(shí)SIS降解了90％，并且降解后的空缺部分完全被新增組織所替代。第9周時(shí)材料已經(jīng)完全降解，僅能看到新生組織。 4．組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在第3周時(shí)有較多的成纖維組織，而對照組則很少，材料內(nèi)主要為大量的炎性細(xì)胞。對照組在6、9周時(shí)成纖維組織的數(shù)量和排列特征均不如實(shí)驗(yàn)組。 5．力學(xué)檢測結(jié)果為，第3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和

7、對照組的抗拉伸強(qiáng)度的均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差分別為169.1±8.5和169.8±9.1，f=-0.116，P>0.05，兩組材料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第6周時(shí)分別為197.3±9.1，172.7±13.7，t=2.974，P<0.05，第9周時(shí)分別為243.5±7.8，192.7±9.3，t=8.336，P<0.05。第6周和第9周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對照組的標(biāo)本在抗拉伸強(qiáng)度上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)論】 (1)前3代肌腱細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，2～3代的肌腱