大鼠ESC復(fù)合豬小腸粘膜下層體外構(gòu)建組織工程皮膚的實驗研究.pdf

1、本實驗通過體外觀察表皮干細胞的生長、擴增和分化，探討表皮干細胞的分化發(fā)生機制，利用組織工程的方法，體外觀察豬小腸粘膜下層促進大鼠全層皮膚缺損的愈合，進一步探討表皮干細胞在皮膚愈合中的變化，為體外構(gòu)建組織工程皮膚提供實驗依據(jù)。 研究材料與方法： 一、實驗動物和材料： (一)實驗動物： wistar大鼠，雌雄不限(由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供)、新鮮豬小腸的空腸段(由沈陽市肉聯(lián)加工廠提供)(二)實驗材料：

2、 DMEM培養(yǎng)液(GIBCO/BRL)，胎牛血清(TDB生物制品公司)，Integrinβ1、p63及keratinl5抗體(neuomaker生物公司)，F(xiàn)ITC/CY3免疫熒光二抗(武漢博士得生物制品公司)，PBS液，0.25％胰蛋白酶． 二、實驗方法： (一)Wistar大鼠表皮干細胞(ESC)的體外分離、培養(yǎng)及鑒定利用胰酶冷熱交替消化組織塊法對Wistar大鼠表皮干細胞進行培養(yǎng)，然后利用相差顯微鏡對培養(yǎng)細胞進

3、行體外連續(xù)觀察，測定克隆細胞形成率(CFE)，通過多聚賴氨酸分離表皮干細胞，進行光鏡、integrin β1、 Keratin 15以及P63細胞免疫熒光、免疫組化染色及掃描電鏡進行觀察。 (二)豬小腸粘膜下層(SIS)的生物學(xué)特性的觀察利用物理和化學(xué)方法制備豬小腸粘膜下層，通過光鏡、電鏡以及圖象分析對其進行觀察及測量，皮下埋植觀察生物相容性。 (三)豬小腸粘膜下層(SIS)修復(fù)全層皮膚缺損過程中皮膚創(chuàng)面邊緣表皮干細胞的

4、定位及再分布觀察隨機挑選40只Wistar大鼠，分別在每個大鼠背部的脊柱兩側(cè)切取面積均為2.54cm<'2>的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，將創(chuàng)面隨機分為2組，即SIS治療組(40個創(chuàng)面)，空白對照組(40個創(chuàng)面)。分別于傷后3天、1周、2周和3周通過組織學(xué)方法檢查，動態(tài)觀察各組治療效果，并以integrin β1、keratin15以及p63免疫組化SP法和FITC/CY3熒光免疫標(biāo)記檢測皮膚創(chuàng)面愈合過程中表皮干細胞在創(chuàng)面邊緣的分布情況。

5、 實驗結(jié)果： 一、表皮干細胞(ESC)的生長特性及組織學(xué)觀察皮膚組織塊消化后浸泡于培養(yǎng)瓶內(nèi)，24小時后，開始有細胞出現(xiàn)，形狀大小不一；此后，細胞不斷從皮膚組織塊中爬行出來。接種3周，可見明顯的集落形成。集落中的細胞不斷擴增，傳代細胞與原代細胞相似，4～5天即可長滿培養(yǎng)瓶。體外連續(xù)觀察2周，發(fā)現(xiàn)毛發(fā)樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在細胞的周圍，數(shù)量較多。細胞明顯克隆樣生長，克隆形成率高，與BMSCS組比較，P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。ESC的in

6、tegrin β1、Keratin 15以及P63的檢測結(jié)果陽性率較高，細胞SP免疫組化和FITC/CY3熒光標(biāo)記的結(jié)果是一致的． 二、豬小腸粘膜下層(SIS)的生物學(xué)特性的觀察光鏡顯示，SIS的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)特點是由淺入深，密度逐漸加大，孔徑率逐漸增加，孔徑直徑逐漸變小，圖像分析結(jié)果，孔徑率在70％-90％之間，平均孔徑大小為250 μm左右。掃描電鏡顯示膠原纖維結(jié)構(gòu)規(guī)整，網(wǎng)孔豐富，纖維連續(xù)。皮下埋植實驗顯示材料具有良好的組織

7、相容性，無明顯炎癥反應(yīng)，血管化早，后期經(jīng)改建可形成纖維排列較規(guī)則的類真皮樣結(jié)構(gòu)。 三、豬小腸粘膜下層(SIS)修復(fù)全層皮膚缺損過程中創(chuàng)緣表皮干細胞的定位及再分布的觀察兩組創(chuàng)面愈合率在SIS組明顯高于空白組。于創(chuàng)緣表皮的棘層或顆粒層出現(xiàn)了散在的integrin β1、K15以及p63免疫熒光和免疫組化染色陽性細胞，且越接近創(chuàng)面這些陽性細胞越密集，其數(shù)量隨著創(chuàng)面的縮小漸漸增加，直到創(chuàng)面愈合。 實驗結(jié)論： 1.利用胰酶

8、冷熱交替消化組織塊法獲得的表皮干細胞(ESC)數(shù)量多，而且較容易發(fā)生分化，可初步實現(xiàn)毛發(fā)體外的分離培養(yǎng)，使體外構(gòu)建組織工程皮膚變?yōu)榭尚小?2.經(jīng)過本實驗方法制備的SIS，韌性大，結(jié)構(gòu)、層次分明，生物相容性良好，血管化能力強，是一種理想的細胞外支架，是組織工程進行組織修復(fù)的良好材料。 3.豬小腸粘膜下層(SIS)可以促進表皮干細胞能動的參與創(chuàng)面的修復(fù)，創(chuàng)緣表皮干細胞再分布的主要機理可能是促進創(chuàng)面再上皮化以及皮膚附屬器的形成