天花粉蛋白核糖體活性位點(diǎn)的刪除及其對(duì)APC基因甲基化作用的影響.pdf

1、目的:宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中存在DNA甲基化水平和模式的紊亂,DNA甲基化異?？捎绊懓┗蚝鸵职┗虻谋磉_(dá)而參與腫瘤的形成。天花粉蛋白(TCS)具有對(duì)多種高甲基化狀態(tài)的抑癌基因啟動(dòng)子進(jìn)行去甲基化的作用,并由此上調(diào)這些抑癌基因的表達(dá)水平,但是TCS發(fā)揮去甲基化的機(jī)制尚未闡明。在前期天然天花粉蛋白(nTCS)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和逆轉(zhuǎn)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化的研究基礎(chǔ)上,本課題重點(diǎn)研究nTCS抗宮頸癌和去甲基化的機(jī)制。
　　方法:1.利用

2、重疊延伸PCR得到活性位點(diǎn)突變的天花粉蛋白(mTCS)的目的片段,將其插入到pET-28a(+)空載中,成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-mTCS轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)mTCS,用金屬鎳螯合層析法純化mTCS后進(jìn)行Western-blot鑒定;2.酶活性分析檢測(cè)mTCS生物活性,MTT法檢測(cè)mTCS和nTCS對(duì)宮頸癌 HeLa細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mTCS和nTCS對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影

3、響;3甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)人宮頸癌Hela細(xì)胞中APC基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài),反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和半定量PCR法研究mTCS和nTCS對(duì)APC基因mRNA表達(dá)水平的影響,Western-blot法檢測(cè)mTCS和nTCS對(duì)APC基因蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:1.IPTG可誘導(dǎo)mTCS在E.coli中表達(dá),溫度較低的培養(yǎng)環(huán)境(30℃)有利于表達(dá);用Ni2+-NTA樹脂親和層析法從誘導(dǎo)表達(dá)菌中獲得了

4、較高純度的mTCS;DNA酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)刪除核糖體活性位點(diǎn)的天花粉蛋白體外切割超螺旋DNA的作用喪失;2.MTT法分析表明在0-100μg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度的增加,nTCS對(duì) HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸增大,與對(duì)照組相比存在顯著差異(P﹤0.01),不同濃度 mTCS處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用;流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)nTCS可以阻滯細(xì)胞于 S期,從而抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng),mTCS不能發(fā)揮這一作用;3.MSP法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)宮頸

5、癌HeLa細(xì)胞中APC基因?yàn)楦呒谆癄顟B(tài),80mg/L nTCS處理48h后,APC基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化,但是經(jīng)80mg/L mTCS處理后 APC基因高甲基化狀態(tài)沒有改變;RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),在TCS處理前APC基因mRNA水平為低表達(dá),經(jīng)80mg/L的mTCS處理后mRNA表達(dá)水平?jīng)]有變化,但經(jīng)80mg/L的nTCS處理后mRNA表達(dá)水平顯著升高;Western-blot法檢測(cè)Hela細(xì)胞APC蛋白水平的變化發(fā)現(xiàn),與對(duì)照細(xì)胞比較,

6、80mg/L mTCS處理的Hela中APC蛋白含量無顯著變化,但經(jīng)80mg/L nTCS處理的細(xì)胞內(nèi)APC蛋白含量顯著增高。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功地在E.coli中原核表達(dá)和純化出mTCS,DNA酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)刪除核糖體活性位點(diǎn)的天花粉蛋白體外切割超螺旋 DNA的作用喪失,nTCS能夠抑制宮頸癌 HeLa細(xì)胞的增殖,并且能夠阻滯 HeLa細(xì)胞周期于S期,從而發(fā)揮抗腫瘤藥理作用。純化的mTCS對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖沒有明顯抑制作用。