卡介苗HSP70基因轉染白血病細胞瘤苗制備及抗瘤機制的研究.pdf

1、摘要第一部分：卡介苗HSP70基因轉染HL60細胞瘤苗制備及抗瘤機制的研究目的構建卡介苗熱休克蛋白70(BCGHSP70)的真核表達載體，通過基因轉染表達于急性早幼粒白血病細胞標準細胞株(HL60)細胞表面，制備細胞膜表面修飾的瘤苗并研究其抗瘤作用和機制。方法(1)BCGHSP70基因重組載體構建及序列測定：利用PCR方法從卡介菌基因組中擴增出帶酶切位點的BCGHSP70基因，與真核質(zhì)粒表達載體pDisplay連接，構建重組載體pDis

2、playHSP70并進行DNA測序鑒定。(2)膜表面表達BCGHSP70的HL60細胞瘤苗的制備：利用脂質(zhì)體2000將重組載體pDisplayHSP70轉染HL60細胞，免疫熒光單克隆抗體進行細胞表面修飾鑒定。(3)轉染后的HL60細胞抗原性檢測：實驗組分為3個亞組：l組：未進行轉染的HL60細胞組(HL60wt)；2組：轉染空載體pDisplay的HL一60細胞組(HL60一pDisplay)；3組：轉染重組載體pDisplayHSP

3、70的HL60細胞組(HL60HSP70)；收獲各組HL60細胞，絲裂霉素C滅活后與同種異體外周血T淋巴細胞按照1：10比例混合培養(yǎng)72h，CFSE標記和流式細胞術測定淋巴細胞增殖指數(shù)，EHSA法檢測細胞因子IFN丫水平；絲裂霉素c滅活后的HL60細胞與T淋巴細胞按照1：10比例混合培養(yǎng)48h后，加入野生型HL60細胞(效應細胞：靶細胞分別為10：1，20：1，40：1，80：1)共培育12h，LDH釋放改良法檢測細胞毒性T淋巴細胞(C

4、TL)的殺傷活性。結果(1)PCR擴增獲得的BCGHSP70基因大小與GeneBank公布的結核桿菌HSP70基因一致。酶切電泳和DNA測序證實重組載體pDisplayHSP70構建正確。(2)共聚焦顯微鏡觀察檢測證實BCGHSP70表達在轉染后的HL一60細胞表面。(3)轉染后的HL60細胞免疫原性檢測結果：①異體淋巴細胞增殖數(shù)：與實驗HL60wt組、HL60pDisplay組比較，HL60一HSP70組能明顯促進異體T細胞擴增(p0

5、05)。②細胞因子水平：HL60一wt組、HL60pDisplay組、HL60HSP70組IFN吖含量分別為(10023士355)pg／ml，(10268323)pg／ml，(14601298)pg／ma。HL60一HSP70組明顯高于HL60wt第二部分：卡介苗HSP70基因轉染新鮮白血病細胞瘤苗制備及抗瘤機制的研究目的體外培養(yǎng)自血病細胞，并制備膜表面表達卡介苗熱休克蛋白70(BCGHSP70)的瘤苗，以進一步研究其抗瘤作用和機制。方

6、法(1)新鮮白血病細胞的體外培養(yǎng)及其鑒定：分離收集15例急性髓系白血病(AML)細胞，用含細胞因子(SCF、FL、IL3和IL6)的無血清培養(yǎng)液Stemspall⑧體外培養(yǎng)，和15例B系急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞，含細胞因子(SCF、FL、IL3和IL7)的無血清IMDM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，通過顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)、細胞化學染色和免疫表型測定驗證所培養(yǎng)的白血病細胞。(2)膜表面表達BCGHSP70的白血病細胞瘤苗的制備：利用脂質(zhì)體2

7、000將重組載體pDisplayHSP70轉染到已被鑒定的白血病細胞，免疫熒光單克隆抗體進行細胞表面修飾鑒定。(3)轉染后的白血病細胞免疫原性檢測：實驗組分為3個亞組：1組：未進行轉染的自血病細胞組(wtLC)；2組：轉染空載體pDisplay的白血病細胞組(pDisplayLC)；3組：轉染重組載體pDisplayHSP70的白血病細胞組(HSP70LC)；收獲各組白血病細胞，絲裂霉素C滅活后與獲得完全緩解的急性白血病患兒自體骨髓T淋

8、巴細胞按1：10比例混合培養(yǎng)72h，CFSE標記和流式細胞術測定淋巴細胞增殖指數(shù)，ELISA法檢測細胞因子IFNY水平；絲裂霉素C滅活后的各組白血病細胞與T淋巴細胞按照1：10比例混合培養(yǎng)48h后，加入新鮮白血病細胞(效應細胞：靶細胞分別為10：1，20：1，40：1，80：1)共培育12h，LDH釋放改良法檢測細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的殺傷活性。結果(1)短期培養(yǎng)的白血病細胞呈集落樣懸浮生長，并保持增殖特性；在培養(yǎng)的110天，細胞

9、增殖較快，以后逐漸變慢。懸浮培養(yǎng)第10天收集細胞進行免疫表型測定，15例AML細胞的CDl3、CD33表達，與培養(yǎng)前比較差異無統(tǒng)計學意義(p005)；15例BALL細胞的CDl9、CDl0、CD22表達，與培養(yǎng)前比較差異無統(tǒng)計學意義(p005)。(2)共聚焦顯微鏡觀察檢測證實BCGHSP70表達在轉染后的白血病細胞表面。(3)轉染后的白血病細胞免疫原性檢測結果：①自體淋巴細胞增殖：實驗wtLC組、pDisplayLC組、HSP70LC組