高羊茅耐鹽基因工程育種及耐鹽植物脅迫相關(guān)基因NHX-TaPOD-TaPOX的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、土壤鹽堿化是一個(gè)世界性的問題，現(xiàn)在進(jìn)行鹽地開發(fā)的有效途徑是培育新型的耐鹽作物品系。草業(yè)可持續(xù)發(fā)展是我國經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要保證，而抗旱、耐鹽堿牧草育種則是我國草業(yè)發(fā)展的重大技術(shù)需求和提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的一項(xiàng)基本國策。高羊茅(tallfescue，F(xiàn)estuca arundinacea Schreb．)屬于禾本科羊茅屬(Festuca)，為多年生草本植物。高羊茅是一種多年生冷季型草，營養(yǎng)價(jià)值極高，具有耐瘠薄、抗銹病、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，作為牧草

2、和草坪草都有廣泛的應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)改良其耐逆性對保持草坪四季常綠，節(jié)約水資源，擴(kuò)大建植區(qū)域，尤其是對改善我國西部地區(qū)的生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義。作為“國家十五重大科技專項(xiàng)一轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)課題”的資助項(xiàng)目之一，本研究建立了高羊茅組織培養(yǎng)再生體系、構(gòu)建Na<'+>/H<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因遺傳轉(zhuǎn)化載體、建立了有效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)高羊茅轉(zhuǎn)基因方法、對轉(zhuǎn)基因植株完成了分子鑒定和遺傳分析及后代的耐鹽性測定，獲得耐逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因

3、T<,2>代株系，為牧草轉(zhuǎn)基因新品種的培育奠定了基礎(chǔ)。此外，本實(shí)驗(yàn)從耐鹽植物高冰草及小麥/高冰草體細(xì)胞雜種耐鹽小麥新品種山融3號中分別克隆了與耐逆相關(guān)的Na<'+>/H<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和過氧化物酶基因，初步分析其在植物耐逆中的可能作用。 1．Na<'+>/H<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHXl對高羊茅耐鹽的作用鹽堿地對于植物生長的影響主要是通過Na<'+>對細(xì)胞的毒害作用引起。本實(shí)驗(yàn)建立了8種高羊茅下胚軸組織培養(yǎng)再生體系

4、，以其中4種Forager、BLASER、G1和Fine-Lawn的胚性愈傷組織為材料，將篩選基因npt Ⅱ和由煙草CaMV 35S和玉米Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的擬南芥Na<'+>/H<'+>逆向運(yùn)輸?shù)鞍谆驅(qū)脒@4個(gè)品種中，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化體系并且獲得了可遺傳的高羊茅轉(zhuǎn)基因后代。 To代PCR分析和基因組Southern雜交鑒定證實(shí)了AtNHXl基因已經(jīng)整合到高羊茅基因組中，并以單拷貝或雙拷貝形式存在。T<,1>

5、-T<,2>代的PCR和Southern雜交證實(shí)轉(zhuǎn)基因后代遺傳了AtNHXl，RT-PCR分析表明外源基因AtNHXl在轉(zhuǎn)基因后代中表達(dá)，并且不同株系的表達(dá)量有差異。通過耐鹽生理指標(biāo)分析轉(zhuǎn)基因高羊茅后代的耐鹽性，證明轉(zhuǎn)基因高羊茅通過Na<'+>在液泡中的區(qū)隔化，降低了葉片細(xì)胞質(zhì)中Na<,+>濃度，從而提高植株的耐鹽性。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們從轉(zhuǎn)基因T2株系中選出4個(gè)單拷貝插入、遺傳穩(wěn)定、耐鹽性強(qiáng)的株系申請安全性環(huán)境釋放，已經(jīng)獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)(

6、批準(zhǔn)號：No．2006-T048)。本研究為高羊茅的基因工程育種與遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。 2．單子葉耐鹽植物Na<'+>/h<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全長cDNA克隆及與擬南芥該基因?qū)χ参锬望}性的比較研究本實(shí)驗(yàn)從耐鹽植物高冰草(Agropyron elongatum Host Nevski)中克隆了Na<'+>/h<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全長cDNA序列TeNHX1和TeNHX2，并且與其它植物進(jìn)行了聚類分析。通過鹽敏感酵母突變

7、體(AXT3)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)比較了高冰草TeNHXl、TeNHX2、高羊茅FaNHX(本實(shí)驗(yàn)室克隆)和擬南芥．AtNHXl對耐鹽性的不同貢獻(xiàn)。結(jié)果表明：’TeNHXl、TeNHX2、FaNHX1的氨基酸序列與濱藜、水稻、大麥、小麥Na<'+>/H<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高的同源性，高冰草TeNHXl與小麥TaNHX及水稻OsNHX2較近緣，而高冰草TeNHX2與大麥HvNHXZ及水稻OsNHXI的親緣關(guān)系更近一些。在200 mM鹽濃度下，F(xiàn)

8、aNHX1和TeNHX1對酵母突變體的互補(bǔ)效果最好，其次是TeNHX2，而AtNHX1最差，這可能是由于非保守區(qū)序列上的差異造成了不同植物Na<'+>/H<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性不同。 對高冰草的RT-PCR分析表明：NHX基因的表達(dá)具有組織特異性，在鹽處理下表達(dá)量有變化，這與其區(qū)隔化Na<'+>的功能一致。在沒有鹽誘導(dǎo)的條件下，根和葉中均有表達(dá)，說明在正常生長條件下NHX也具有維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡的作用，NHX在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)可

9、能是決定植物耐鹽能力的重要因素。分別構(gòu)建了這幾個(gè)不同來源Na<'+>/H<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)載體，對單/雙子葉模式植物擬南芥/水稻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步通過過量表達(dá)分析基因功能奠定了基礎(chǔ)。為不同植物NtlX基因功能的比較研究及其在基因工程中應(yīng)用以及評價(jià)不同學(xué)者對NHX基因功能的爭議提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3.小麥與高冰草體細(xì)胞雜種耐鹽新品種山融3號耐逆相關(guān)過氧化物酶基因的克隆利用不對稱體細(xì)胞雜交技術(shù)可向小麥轉(zhuǎn)移異源

10、植物的耐鹽基因。本實(shí)驗(yàn)室以普通小麥(Triticum aestivum L)濟(jì)南177胚性懸浮細(xì)胞來源的原生質(zhì)體為受體，野生耐鹽近源植物高冰草(Agropyron elongatum Host Nevski)懸浮細(xì)胞系原生質(zhì)體經(jīng)紫外線照射后為供體，進(jìn)行不對稱體細(xì)胞雜交，在國際上首次獲得了體細(xì)胞雜種后代株系。經(jīng)過連續(xù)多年的實(shí)驗(yàn)室及大田耐鹽實(shí)驗(yàn)，已篩選出耐鹽新品種山融3號。利用mRNA差異顯示技術(shù)、基因芯片信息和RACE技術(shù)，從山融3號中克

11、隆和分離了鹽脅迫相關(guān)的過氧化物酶全長cDNA序列TaPOD和TaPOX。 TaPOD開放閱讀框編碼322aa，編碼蛋白質(zhì)分子量為33.3 kD，推測等電點(diǎn)pI=6.11。NCBI中BLAST。結(jié)果表明，該序列編碼class Ⅲ peroxidase，與水稻中的同源基因的蛋白相似性達(dá)到85﹪，跨膜區(qū)分析表明其含有兩個(gè)跨膜區(qū)。TaPOX開放閱讀框編碼342aa，編碼蛋白質(zhì)分子量為36.5 kD，推測等電點(diǎn)pi=5.81.NCBI中B

12、LAST結(jié)果表明，該序列編碼peroxidase，與一粒小麥中的同源基因Triticum monococcumperoxidase 10的蛋白相似性達(dá)到98﹪，含有兩個(gè)跨膜區(qū)。 高冰草、濟(jì)南177和山融3號的基因組的Southern雜交分析表明：TaPOD基因在高冰草、濟(jì)南177和山融3號的基因組中存在多個(gè)拷貝或同源基因。山融3號基因組中雜交信號數(shù)目介于兩個(gè)親本之間，并且有不同于親本的雜交信號產(chǎn)生，表明山融3號的耐鹽性可能與Ta

13、POD基因相關(guān)。 進(jìn)一步采用RT-PCR的方法分析了山融3號中TaPOD和TaPOX在逆境下的表達(dá)模式，從而探討了它們在抵抗逆境反應(yīng)中可能的功能。RT-PCR和Northern雜交表明：TaPOD基因在NaCI脅迫6小時(shí)的山融3號根中表達(dá)量明顯增強(qiáng)/葉中表達(dá)無明顯差異；而在濟(jì)南177的葉中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)/根中鹽脅迫早期表達(dá)下調(diào)。PEG處理后，在山融3號的根、葉以及濟(jì)南177的根中，TaPOD表達(dá)量均無明顯差異，但是在177的葉

14、中，TaPOD表達(dá)量在PEG脅迫初期表達(dá)下調(diào)，隨著脅迫時(shí)間的延長其表達(dá)量又上升。TaPOX基因在山融3號根中隨著PEG脅迫時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，在正常山融3號的葉中不表達(dá)，但是在脅迫初期(1小時(shí))表達(dá)上調(diào)：該基因在177的根和葉均為脅迫初期表達(dá)量降低，而后隨著脅迫時(shí)間的延長表達(dá)量又有上升。這些結(jié)果表明過氧化物酶基因通過轉(zhuǎn)錄水平的變化調(diào)節(jié)小麥的耐逆性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對山融3號和JN177的雙向電泳一質(zhì)譜的分析結(jié)果，從山融3號鹽脅迫誘導(dǎo)特

15、異表達(dá)的蛋白點(diǎn)中檢測到多個(gè)過氧化物酶，其中．POX10與本實(shí)驗(yàn)TaPOX對應(yīng)。對比本實(shí)驗(yàn)室基因芯片分析結(jié)果表明，鹽脅迫下TaPOD在山融3號的根中表達(dá)上調(diào)，在濟(jì)南177的根中表達(dá)下調(diào)；而鹽脅迫下TaPOX在山融3號和濟(jì)南177的根中表達(dá)均為上調(diào)。芯片分析發(fā)現(xiàn)有兩類過氧化物酶在山融3號的特異表達(dá)，表明有兩種不同類型的過氧化物酶分別參與干旱和高鹽脅迫，二者參與脅迫的機(jī)制不同。這些結(jié)果初步表明：在鹽害與干旱脅迫時(shí)，山融3號基因組中與抗氧化脅迫

16、相關(guān)的基因起重要作用。這些新基因都可望用于牧草的耐鹽基因工程育種。 利用TaPOD基因?qū)ι饺?號進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，PCR和Southern雜交分析證明該基因已經(jīng)插入到山融3號基因組。對轉(zhuǎn)化植株的POD同工酶分析表明：過表達(dá)TaPOD的轉(zhuǎn)基因山融3號小麥的POD同工酶譜發(fā)生明顯變化，比山融3號多了1～3條POD譜帶。過氧化物酶是一種對環(huán)境條件十分敏感的氧化酶類，其同工酶(POD)譜帶的變化在一定程度上能反映植物抗鹽性的強(qiáng)弱。過氧化物