六價(jià)鉻對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞ABP、Tf和INHmRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、鉻(Chromium,Cr)作為一種重要的天然金屬元素,無(wú)論在自然界中還是在工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中,都與人們的活動(dòng)息息相關(guān)。鉻及其化合物特別是六價(jià)鉻[Cr(Ⅵ)]在許多工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。同時(shí),隨著社會(huì)的不斷發(fā)展,環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重,鉻及其化合物也包含在汽車尾氣中。實(shí)驗(yàn)表明,鉻及其化合物有免疫毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性、致癌性和腎毒性。其中關(guān)于鉻及其化物對(duì)生殖的影響逐漸被人們所重視。
　　 男性生殖能力下降,以致不育癥越來(lái)越多,這已是不爭(zhēng)

2、的事實(shí)。而Cr(Ⅵ)易進(jìn)入生殖細(xì)胞內(nèi)從而影響生殖系統(tǒng)的正常功能。睪丸為雄性生殖系統(tǒng)中最重要的生殖腺,同時(shí)也是大多數(shù)外源化學(xué)物生殖毒性的靶器官。而作為睪丸曲細(xì)精管內(nèi)唯一的體細(xì)胞-支持細(xì)胞(Sertoli cell,SC),在雄性生殖系統(tǒng)中起著重要作用。SC能夠分泌雄激素結(jié)合蛋白(androgen binding protein,ABP)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tf)和抑制素(inhibin,INH)等,此三者在雄性生殖中起著至

3、關(guān)重要的作用,ABP、Tf和INH已經(jīng)被廣泛地用作衡量SC功能的標(biāo)志。
　　 目的:
　　 本研究通過體外原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞,然后使其暴露于不同濃度的Cr(Ⅵ),從mRNA水平和蛋白表達(dá)水平分析Cr(Ⅵ)對(duì)支持細(xì)胞表達(dá)ABP、Tf和INH的影響。以此探討重鉻酸鉀對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響,為進(jìn)一步研究Cr(Ⅵ)的雄性生殖毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.首先建立大鼠睪丸支持細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)

4、模型。
　　 2.利用。MTT比色法來(lái)測(cè)定Cr(Ⅵ)對(duì)支持細(xì)胞活性的影響,并且確定染毒濃度。
　　 3.用實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)支持細(xì)胞ABP、Tf和INH mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 4.Western blot法檢測(cè)Cr(Ⅵ)作用后ABP、Tf和INH的蛋白表達(dá)水平。
　　 5.統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用Levene方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析(analysis of varia

5、nce,ANOVA),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過本實(shí)驗(yàn)方法,提取的大鼠SC存活率95％以上,24 h后細(xì)胞開始貼壁,48 h后鋪開生長(zhǎng)良好,純化后細(xì)胞純度90％以上。
　　 2.MTT法結(jié)果:當(dāng)濃度為10-6 mol／L時(shí),與對(duì)照組進(jìn)行比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),大于此濃度時(shí),細(xì)胞存活率影響明顯,因此本課題進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)采用10-8 mol／L、10-7mo

6、l／L和10-6 mol／L3個(gè)濃度。
　　 3.實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果:與對(duì)照相比,ABP mRNA與INH mRNA在染毒濃度為10-7mol／L和10-6 mol／L時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Tf mRNA在染毒濃度為10-6 mol／L時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.ABP、Tf和INH蛋白的表達(dá)結(jié)果:與對(duì)照組相比,ABP與INH的蛋白相對(duì)表達(dá)量在10-6mol／L濃度時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)