淫羊藿苷對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞體外增殖的影響及分子機(jī)制的研究.pdf

1、睪丸支持細(xì)胞（Sertoli Cells，SCs）及其結(jié)構(gòu)是由意大利組織學(xué)家Enrico Sertoli于1865年首先進(jìn)行描述的。支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性保證了精子發(fā)生的正常進(jìn)行，在曲細(xì)精管中，各級(jí)生精細(xì)胞鑲嵌在支持細(xì)胞上，為生精細(xì)胞提供支架。同時(shí)，支持細(xì)胞能夠分泌類固醇類、激素類、調(diào)節(jié)蛋白類、生長(zhǎng)因子類、旁分泌因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類等為生精細(xì)胞分化成熟提供穩(wěn)定的環(huán)境及必須的能量物質(zhì)，保證精子正常有序的發(fā)生。近年來(lái)研究已經(jīng)證實(shí)支持細(xì)胞分泌Fas

2、L是其免疫豁免的重要基礎(chǔ)。臨床上，已經(jīng)利用睪丸支持細(xì)胞免疫豁免的功能進(jìn)行了對(duì)人類神經(jīng)退行性疾病的治療。近年有學(xué)者已成功證實(shí)將睪丸支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層能夠顯著促進(jìn)多種干細(xì)胞的增殖。因此支持細(xì)胞已成為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、組織工程及器官移植等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，在臨床移植領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　淫羊藿苷（Icariin，ICA）來(lái)源于天然植物，是中藥淫羊藿（Epimedium brevicornum Maxim）的主要活性成分，它是一種安

3、全、有效、經(jīng)濟(jì)的天然植物?，F(xiàn)代藥理研究表明，ICA能夠促進(jìn)生殖系統(tǒng)的發(fā)育與成熟、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、促進(jìn)造骨細(xì)胞的增殖和分化、提高免疫功能及具有抗癌的作用，然而其部分作用機(jī)制尚不明確。所以本研究旨在觀察ICA對(duì)SCs體外增殖的影響，并進(jìn)一步探討ICA可能促進(jìn)SCs體外增殖的保護(hù)作用。故研究SCs體外培養(yǎng)及其增殖具有重要的臨床意義。
　　本實(shí)驗(yàn)分為三部分：
　　第一部分：原代大鼠睪丸支持細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)及鑒定
　　研

4、究目的：
　　分離培養(yǎng)活力及純度較高的原代睪丸支持細(xì)胞（SCs）。
　　研究方法：
　　選取8-9天的SD大鼠，采用兩步酶法分離并進(jìn)行睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)，48h后，用PH值7.4 Tris-HCL低滲去除污染的間質(zhì)細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的存活力。利用免疫熒光檢測(cè)睪丸支持細(xì)胞特異性分泌的雄激素結(jié)合蛋白（androgen binding protein，ABP）及結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　研究

5、結(jié)果：
　　通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力和活細(xì)胞形態(tài)學(xué)彩圖，顯示兩步酶法獲取的睪丸支持細(xì)胞的活力達(dá)95％以上。經(jīng)免疫熒光染色及結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞的形態(tài)，獲取的睪丸支持細(xì)胞48h之后純度達(dá)到95%以上。
　　研究結(jié)論：
　　1、兩步酶法分離培養(yǎng)原代睪丸支持細(xì)胞步驟更加簡(jiǎn)單，污染的其他生殖細(xì)胞數(shù)量更少。
　　2、通過(guò)鏡下觀察、結(jié)晶紫染色及免疫熒光鑒定，證實(shí)兩步酶法獲取的原代睪丸支持細(xì)胞純度以及細(xì)胞活力均達(dá)95%以上。<

6、br>　　第二部分淫羊藿苷對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞體外增殖的影響
　　研究目的：
　　用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、直接細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)睪丸支持細(xì)胞體外增殖的影響。
　　研究方法：
　　采用MTT法檢測(cè)ICA對(duì)睪丸支持細(xì)胞體外增殖的作用，并確定ICA的有效劑量和作用時(shí)間。分別用0μM,5μM,10μM,15μM,20μM及25μM不同濃度ICA對(duì)SCs處理24h，以及根據(jù)已確定有效劑量10μM作用于SCs0h,6h

7、,12h,24h及48h不同時(shí)間點(diǎn)，采用MTT法，在酶標(biāo)儀下檢測(cè)每孔光密度值來(lái)觀察經(jīng)藥物作用后睪丸支持細(xì)胞的活力；為了避免MTT法的不足，我們采用血小板直接計(jì)數(shù)不同劑量ICA處理24h后以及10μM處理的不同時(shí)間點(diǎn)的48孔板中SCs的數(shù)量，此方法比MTT更加精確，誤差更小，但較MTT繁瑣；為了避免MTT以及直接細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差，多種檢測(cè)方法互相印證，我們又采用熒光標(biāo)記物CFSE標(biāo)記培養(yǎng)于六孔板中的SCs，SCs的處理?xiàng)l件同MTT及細(xì)胞計(jì)數(shù)

8、，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，隨著細(xì)胞增殖，整合至細(xì)胞中的CFSE平均分配于子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度也逐漸減弱，利用這一特點(diǎn)可觀察細(xì)胞的增殖能力。
　　研究結(jié)果：
　　通過(guò)MTT、直接細(xì)胞計(jì)數(shù)以及熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，觀察ICA對(duì)SCs的增殖的影響，我們發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，ICA5μM組細(xì)胞光密度值、細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化（p﹥0.05），ICA10μM,15μM，20μM及25μM各組細(xì)胞生長(zhǎng)光密度值及細(xì)胞數(shù)量明

9、顯增高，熒光強(qiáng)度顯著減弱（p﹤0.05）。ICA10μM處理的SCs隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增殖明顯增加，24h及48h時(shí)間點(diǎn)SCs光密度值及細(xì)胞數(shù)量明顯增高，熒光強(qiáng)度明顯減弱（p﹤0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　以上各種方法證明，ICA能夠顯著促進(jìn)SCs的體外增殖，并且呈現(xiàn)時(shí)間及劑量依賴性。
　　第三部分：淫羊藿苷促進(jìn)大鼠睪丸支持細(xì)胞體外增殖的機(jī)制研究
　　研究目的：
　　探討淫羊藿苷促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞體外增殖作用

10、的機(jī)制。
　　研究方法：
　　MAPKs，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。其主要作用是將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等。截至目前，在哺乳類細(xì)胞已發(fā)現(xiàn)存在著下述三條并行的MAPKs信號(hào)通路，即ERK、JNK及p38信號(hào)通路，研究證實(shí)，ERK信號(hào)通路主

11、要參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控，而JNK及p38主要參與氧化應(yīng)激、炎癥與細(xì)胞凋亡等的調(diào)控。因此在實(shí)驗(yàn)中，我們分別將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、ICA組（只加藥）、UO126組、UO126+ICA、SP600125組、SP600125+ICA、SB203580組及SB203580+ICA組，用以上三種信號(hào)通路的特異性阻斷劑，即 ERK阻斷劑 UO126、JNK阻斷劑SP600125、p38的阻斷劑SB203580分別預(yù)處理SCs之后加入10μM濃度的

12、ICA作用24h后，用MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的光密度值、細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)細(xì)胞增殖有影響的阻斷劑作用于細(xì)胞，處理SCs24h后，提取各組細(xì)胞蛋白，用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中磷酸化ERK1/2及總ERK1/2的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　MTT檢測(cè)各組光密度值顯示，與空白對(duì)照組相比，ICA組（只加藥）光密度值明顯增加(p﹤0.05)，UO126與UO126+ICA組光密

13、度值顯著低于空白對(duì)照組(p﹤0.05)，其余各組與空白對(duì)照組之間以及各組之間無(wú)明顯差異（p﹥0.05）；直接細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示ICA組（只加藥）細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他各組(p﹤0.05)，UO126與 UO126+ICA組細(xì)胞數(shù)量顯著低于其余各組，SP600125組、SP600125+ICA、SB203580組及SB203580+ICA組與空白對(duì)照組之間無(wú)明顯差異（p﹥0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度顯示結(jié)果與MTT及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果一致；因

14、此，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們用Western blot方法檢測(cè)p-ERK1/2及ERK1/2的表達(dá)水平顯示，p-ERK1/2的表達(dá)隨著ICA的劑量增加及時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，加入ERK1/2信號(hào)通路的阻斷劑 UO126之后，與空白對(duì)照組及 ICA組相比較，只有UO126與 UO126+ICA組p-ERK1/2的表達(dá)受到顯著抑制(p﹤0.05)，ICA組p-ERK1/2顯著高于其余各組(p﹤0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1、ERK