脂多糖所致小鼠睪丸支持細(xì)胞GDNF表達(dá)減少對(duì)精原干細(xì)胞的影響.pdf

1、目的及意義:
　　 睪丸炎(Orchitis)是男性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的非特異性感染，可影響精子的數(shù)量和質(zhì)量，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致不育。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，也是感染發(fā)生時(shí)誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要物質(zhì)，腹腔注射LPS可建立大鼠睪丸炎模型。因此，探討LPS在睪丸炎所致不育中的作用機(jī)制，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 精原干細(xì)胞(Spermatogonia

2、l Stem cells，SSCs)位于睪丸生精小管基底膜上，是體內(nèi)自然狀態(tài)下唯一能將遺傳信息傳至子代的成體干細(xì)胞，它既能通過(guò)自我更新保持自身數(shù)量的穩(wěn)定，又能通過(guò)一系列的分化過(guò)程最終形成精子，SSCs自我更新和分化之間的平衡保證雄性生命過(guò)程中精子發(fā)生的持續(xù)進(jìn)行，一旦該平衡被打破則可能導(dǎo)致精子發(fā)生的障礙:過(guò)度增殖導(dǎo)致生殖細(xì)胞腫瘤，而過(guò)度分化則會(huì)導(dǎo)致雄性不育。
　　 睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell，SCs)位于睪丸生精小管內(nèi)

3、皮，由德國(guó)組織學(xué)家Enrico Sertoli于1865年發(fā)現(xiàn)并描述，它為SSCs提供非常關(guān)鍵的支持和營(yíng)養(yǎng)作用。Sertoli細(xì)胞產(chǎn)生的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell-linederived neurotrphic factor，GDNF)是一種調(diào)控SSCs自我更新最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，而干細(xì)胞因子(SCF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)是由Sertoli細(xì)胞分泌的、能夠調(diào)控SSCs分化的關(guān)鍵因子。目前已有證據(jù)表明，LPS可

4、以使SCs的多種細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生變化，但尚未有人研究LPS處理SCs對(duì)SSCs的影響及其機(jī)制。
　　 本研究通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠SCs和SSCs，利用免疫熒光染色和RT-PCR實(shí)驗(yàn)，探討了LPS處理SCs對(duì)小鼠SSCs分化和自我更新的影響，并進(jìn)一步利用RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)探討了造成該影響的原因。進(jìn)一步闡明了LPS導(dǎo)致的睪丸炎所致的不育的發(fā)生的機(jī)制，為男性不育癥的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:

5、
　　 1.SCs的體外培養(yǎng)和分組處理取5～6周齡昆明小白鼠睪丸組織，采用兩步酶法消化，差異貼壁法純化小鼠睪丸SCs，將細(xì)胞分為4組，分別是:正常對(duì)照組（Con組）、添加LPS處理1d組（1d組）、處理2d組（2d組）、處理3d組（3d組），LPS在培養(yǎng)液中的終濃度均為10μ g/mL。處理后去除含LPS的培養(yǎng)液并加入不含LPS的新鮮SSCs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集4組培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)液，分別與無(wú)GDNF新鮮SSCs培養(yǎng)液1

6、∶1混合后待用;同時(shí)收集各組細(xì)胞保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.SSCs的體外培養(yǎng)和分組處理取5～7日齡昆明小乳鼠睪丸組織，按兩步酶法消化，差異貼壁法純化小鼠睪丸SSCs，將細(xì)胞分為4組，分別是:Con組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，分別用前面制備待用的4組培養(yǎng)液培養(yǎng)96h，收集各組細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光染色和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中PLZF、oct4、PCNA和c-kit、sohlh2基因的表達(dá)變化，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)SSCs中Bcl6b、Etv5

7、基因的表達(dá)變化。
　　 3.RT-PCR檢測(cè)各組SCs GDNF、SCF、BMP4表達(dá)的變化，western blot檢測(cè)各組SCs GDNF表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.SSCs免疫熒光染色結(jié)果顯示，PLZF與PCNA的表達(dá)按照Con組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的順序遞減，Con組最高，Ⅲ組最低，各處理組與Con組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。c-kit和sohlh2的表達(dá)按照Con組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的

8、順序遞增，Con組最低，Ⅲ組最高，各處理組與Con組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.SSCs RT-PCR結(jié)果顯示，PLZF、oct4基因的mRNA水平按照Con組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組順序降低，各處理組與Con組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而c-kit和sohlh2基因的mRNA水平按照Con組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的順序升高，處理組與Con組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.SS

9、Cs RT-PCR結(jié)果顯示，Bcl6b、Etv5基因的mRNA水平按照Con組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的順序降低，各處理組與Con組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.SCs RT-PCR結(jié)果顯示， GDNF的表達(dá)按照Con組、1d組、2d組和3d組的順序降低，各組與Con組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各處理組SCF、Bmp4的表達(dá)與Con組之間的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 5.SC