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文檔簡(jiǎn)介
1、二十世紀(jì)九十年代以來(lái),,隨著NICU的建立,機(jī)械通氣和表面活性物質(zhì)的普遍應(yīng)用及早產(chǎn)兒治療水平的提高,早產(chǎn)兒存活率大大提高,CLD的發(fā)病率也呈不斷增加的趨勢(shì),嚴(yán)重影響了早產(chǎn)兒的生活質(zhì)量。CLD是當(dāng)前新生兒重癥監(jiān)護(hù)室中常見(jiàn)的并發(fā)癥,加強(qiáng)對(duì)本病的研究,對(duì)提高早產(chǎn)兒的存活率和改善早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量有著重要的意義。高氧肺損傷后,動(dòng)物在臨床病理生理和肺形態(tài)學(xué)改變上與早產(chǎn)兒長(zhǎng)時(shí)間使用正壓通氣和高氧肺損傷后導(dǎo)致的CLD非常相似,因而大多數(shù)學(xué)者利用高氧肺損
2、傷動(dòng)物模型來(lái)研究CLD。目前,CLD詳盡的發(fā)病機(jī)制尚未清楚,CLD的發(fā)生與肺發(fā)育不成熟、氧療和機(jī)械通氣、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及組織異常修復(fù)有關(guān)。國(guó)內(nèi)外的研究表明,新生兒長(zhǎng)期吸入高濃度的氧氣,肺部出現(xiàn)以炎癥和纖維化為主要特征的急慢性肺損傷,是導(dǎo)致CLD的主要危險(xiǎn)因素之一。炎癥是CLD發(fā)病的中心環(huán)節(jié),在CLD發(fā)病的早期,有炎癥細(xì)胞的聚集和可溶性炎性介質(zhì)的釋放,這些因素在后續(xù)的肺組織破壞、修復(fù)和增生過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。高氧可誘導(dǎo)肺中多種細(xì)
3、胞因子的表達(dá),如IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6和TGFβ均參與了此過(guò)程,其確切機(jī)制尚不清楚,這些細(xì)胞因子相互作用、相互誘生,構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)。NF-κB可調(diào)控與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)有關(guān)的許多細(xì)胞因子及黏附分子基因的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)采用常壓高濃度氧(高氧)建立新生鼠CLD模型,觀察肺組織的病理改變及肺組織中NF-κB、TNFα、IL-8的動(dòng)態(tài)變化,探討NF-κB活化與細(xì)胞因子在高氧肺損傷中的作用機(jī)制,為臨床CLD的治
4、療提供理論依據(jù)和實(shí)踐方向。 材料與方法 1.研究對(duì)象新生昆明小鼠80只(10窩,每窩8只)。 2.動(dòng)物模型的建立及動(dòng)物分組新生小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,每組為5窩。實(shí)驗(yàn)組將新生昆明小鼠置于密閉箱中持續(xù)輸入氧氣,維持FiO2>0.90,CO2<0.5,溫度22℃-27℃,濕度50%-70%,每天及時(shí)添加水,飼料及更換墊料;對(duì)照組:FiO2=0.21,溫度、濕度控制同實(shí)驗(yàn)組。 3.標(biāo)本采集及處理每組小鼠分別
5、于實(shí)驗(yàn)后的1、3、7、14、21天處死,取左肺置于10%福爾馬林中固定,制備石蠟切片,右肺制備肺組織勻漿,離心后取上清待測(cè)。 4.實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)石蠟切片HE染色光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化;SABC免疫組化檢測(cè)肺組織中NF-κBp65、TNFα的表達(dá),ELISA檢測(cè)肺組織IL-8。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因
6、素方差分析,顯著性水平為α=0.05。 結(jié)果 1.肺組織的病理改變對(duì)照組出生后肺泡上皮自不規(guī)則結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)育成熟,至21天肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)整,肺泡大小均勻一致,肺泡間隔變薄。實(shí)驗(yàn)組1天表現(xiàn)為肺泡樣結(jié)構(gòu)不規(guī)則,肺泡腔較小,肺泡間隔較厚,與對(duì)照組無(wú)明顯差別;3天時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)逐漸規(guī)整,大小較均勻,肺泡間隔變薄,肺泡腔內(nèi)及肺泡間隔有少許炎性細(xì)胞滲出;7天時(shí)肺泡腔增大,肺泡間隔較薄,14天時(shí)肺泡腔明顯增大,肺泡數(shù)量減少,21天時(shí)正常肺泡結(jié)構(gòu)
7、消失,數(shù)量明顯減少,肺泡腔直徑明顯增大,肺泡間隔菲薄,局部肺間質(zhì)細(xì)胞增加。 2.肺組織NF-κBp65的表達(dá):免疫組化顯示NF-κBp65蛋白在對(duì)照組小鼠肺組織呈陰性或弱陽(yáng)性反應(yīng),部分胞漿呈淺染色,偶見(jiàn)胞核著色;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,各時(shí)間點(diǎn)均呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物不僅分布于陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿中,細(xì)胞核中也呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),表達(dá)分布更廣泛,NF-κBp65蛋白在實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平不同,實(shí)驗(yàn)組1天時(shí)NF-κBp65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為
8、(3.08±0.38)%,高于對(duì)照組的(2.73±0.42)%,但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)組在3天、7天、14天、21天的NF-κBp65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為(14.42±1.12)%、(7.52±0.55)%、(24.30±0.96)%、(10.88±0.76)%,明顯高于對(duì)照組的(4.75±0.40)%、(4.76±0.40)%、(5.50±0.52)%、(5.63±0.46)%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)
9、。14天表達(dá)水平最高,其次為3天。實(shí)驗(yàn)組3天、7天、14天、21天分別與實(shí)驗(yàn)組1天比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 3.肺組織TNFα的表達(dá):免疫組化顯示TNFα蛋白在對(duì)照組小鼠肺組織呈陰性或弱陽(yáng)性反應(yīng);實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,各時(shí)間點(diǎn)均呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),表達(dá)分布廣泛。對(duì)照組均呈低水平表達(dá),1天、3天、7天、14天、21天分別為:(3.03±0.51)%、(3.16±0.27)%、(3.66±0.30)%、(6.53±0.41
10、)%、(5.88±0.46)%。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較TNFα的表達(dá)均具有顯著性差異(p<0.05),實(shí)驗(yàn)組1天時(shí)為(11.06±1.01)%,隨之TNFα蛋白表達(dá)水平進(jìn)行性升高,,3天時(shí)為(41.44±2.23)%、7天時(shí)達(dá)高峰(60.22±2.85)%,以后TNFα蛋白表達(dá)水平逐漸下降,14天為(35.18±1.41)%,至21天為(16.83±0.89)%,仍高于對(duì)照組,未能完全恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)組3天、7天、14天、21天分別與實(shí)驗(yàn)組
11、1天比較TNFα的表達(dá)均具有顯著性差異(p<0.05)。 4.肺組織IL-8的表達(dá):實(shí)驗(yàn)組肺組織IL-8水平均高于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組1天為(63.96±5.40)pg/ml,與對(duì)照組1天的(53.39±9.76)pg/ml比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);隨吸氧時(shí)間延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組肺組織IL-8水平進(jìn)行性升高并一直持續(xù)至21天,實(shí)驗(yàn)組3天、7天、14天、21天分別為(108.17±8.92)pg/ml、(129.14±6.49)p
12、g/ml、(161.80±11.11)pg/ml、(235.35±31.60)pg/ml,明顯高于對(duì)照組的(85.40±8.40)pg/ml、(94.24±5.20)pg/ml、(104.03±4.14)pg/ml、(116.71±5.29)pg/ml,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組3天、7天、14天、21天分別與實(shí)驗(yàn)組1天比較IL-8的表達(dá)均具有顯著性差異(p<0.05)。 結(jié)論 1.本研究建立的新生鼠高
13、氧肺損傷模型是成功的,高氧可造成新生鼠肺組織明顯的病理?yè)p傷,隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng),其病理?yè)p傷逐漸加重。 2.高氧暴露后新生鼠肺組織NF-κB活化并持續(xù)表達(dá),提示NF-κB活化在高氧肺損傷的發(fā)生、發(fā)展中起作用。 3.高氧暴露早期TNFα隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,繼續(xù)暴露時(shí)則逐漸降低,提示TNFα主要在早期的急性炎癥階段起作用,而在后期的纖維化病變中所起的單獨(dú)作用相對(duì)較弱。 4.IL-8的水平升高貫穿于高氧暴露的病程中,
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