胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌Lip40蛋白生物學(xué)特性研究.pdf

1、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是引起豬胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)的病原菌，該病是一種嚴(yán)重的豬呼吸道疾病且具有致死性，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了15種APP血清型。APP的感染以及致病過(guò)程中有許多毒力因子的參與，包括RTX毒素、莢膜多糖、脂多糖、粘附因子、蛋白酶、外膜蛋白以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多種生物信

2、息學(xué)分析軟件，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)APP中共有60種脂蛋白，并從中挑選出一個(gè)具有特殊串聯(lián)重復(fù)序列Q(E/D/P)QPK的脂蛋白Lip40。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)不同血清型APP菌株中，該重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同。通過(guò)BioEdit（7.0版）對(duì)Lip40蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其與多種已知的脂蛋白和Tbp蛋白具有較高的相似性。利用SWISS-model對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示Lip40蛋白由1個(gè)β筒（該β筒由8條β折疊構(gòu)成）以及4條β折疊所構(gòu)成，并通

3、過(guò)WinCoot軟件將Lip40蛋白分別與APP TbpB N lobe、C lobe進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重疊比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Lip40蛋白與兩者的三維結(jié)構(gòu)都具有較高的相似性。
　　為了獲得重組Lip40蛋白，本研究首先通過(guò)PCR克隆到APP SLW01菌株中的lip40基因，目的基因經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，連入pGEX-KG載體，轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得重組蛋白fLip40。經(jīng)免疫印跡分析，rLip40泳道上出現(xiàn)

4、一個(gè)分子量約為56 kDa的雜交帶，表明抗APP的陽(yáng)性血清可以特異性的識(shí)別并結(jié)合rLip40蛋白，說(shuō)明rLip40蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性。另外，本研究以fLip40蛋白為免疫原免疫大白兔，獲得兔抗rLip40多克隆抗體，其效價(jià)可達(dá)1:2×105，表明fLip40蛋白可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，說(shuō)明Lip40蛋白具有良好的免疫原性。
　　為鑒定Lip40蛋白的亞細(xì)胞定位，本研究分別提取APP各亞細(xì)胞蛋白組分，以兔抗fLip

5、40蛋白多克隆抗體為一級(jí)抗體，通過(guò)免疫印跡方法對(duì)Lip40蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其定位于外膜，與之前生物信息學(xué)結(jié)果相同。之后本研究分析了Lip40蛋白在不同應(yīng)激條件下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在高溫、厭氧和低溫等應(yīng)激條件下，Lip40蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上和翻譯水平上均呈現(xiàn)上調(diào)，故認(rèn)為L(zhǎng)ip40蛋白是一個(gè)多重應(yīng)激響應(yīng)因子，并推測(cè)Lip40蛋白可能是APP的毒力因子，可能參與病原菌-環(huán)境以及病原菌-宿主之間的相互作用。
　　本研究分析了L

6、ip40蛋白的免疫保護(hù)性，以rLip40蛋白為免疫原，免疫小鼠，隨后以致死劑量的高致病性APP菌株攻毒，結(jié)果表明Lip40蛋白對(duì)小鼠的保護(hù)率達(dá)到75％，雖然其保護(hù)率低于ApxIA毒素蛋白(100％)和滅活疫苗(91.7％)，但顯著高于空白對(duì)照組。因此，Lip40蛋白可以作為高效APP疫苗研發(fā)的候選蛋白。
　　本研究還以前期構(gòu)建的lip40基因缺失突變株Δlip40為親本，成功構(gòu)建了回復(fù)突變株CΔlip40，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初

7、步分析。穿梭質(zhì)粒pJFF-lip40可在APP中穩(wěn)定遺傳，并且未對(duì)APP生長(zhǎng)能力造成顯著影響。此外，APP SLW01菌株和Δlip40對(duì)氯霉素高度敏感，但回復(fù)突變株CΔlip40較前兩種菌株對(duì)氯霉素抗性明顯增強(qiáng)，表明穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN抗性基因可在APP菌株中穩(wěn)定表達(dá)?；貜?fù)突變株CΔlip40的成功構(gòu)建為分析Lip40蛋白的致病機(jī)制提供了有效材料，本實(shí)驗(yàn)中建立的APP互補(bǔ)菌株構(gòu)建系統(tǒng)以及APP抗性評(píng)價(jià)方法將有助于今后研究APP