豬胸膜肺炎放線桿菌快速檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、　　1.豬胸膜肺炎放線桿菌毒素Ⅳ部分基因片段的克隆及表達(dá)　　參照GenBank中的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropeumoniae，App)血清1型菌株的毒素Ⅳ(ApxⅣ)基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用PCR方法擴(kuò)增得到一1096bp的片段，然后克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)測(cè)序后與GenBank中公布的核酸序列比較，二者同源性達(dá)100﹪，從T-載體中切下目的片段，定向克隆到pET32a(+)中，

2、轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，目的基因獲得高效表達(dá)，免疫轉(zhuǎn)印鑒定呈陽(yáng)性，ApxⅣ部分基因片段體外成功表達(dá)。 2.表達(dá)蛋白rApxⅣ和莢膜多糖粗提物的間接ELISA的建立及應(yīng)用　　App的毒素ApxⅣ的部分片段表達(dá)產(chǎn)物(rApxⅣ)經(jīng)Ni-NTAHis·BindResin純化后，作為抗原建立了間接ELISA(rApxⅣ-ELISA)，經(jīng)試驗(yàn)確定抗原包被濃度為0.625μg/ml，血清檢測(cè)稀釋度

3、為1：100，抗原與抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間為90分鐘。用該ELISA檢測(cè)了72份實(shí)驗(yàn)室制備的豬血清樣品，結(jié)果預(yù)示表達(dá)蛋白可用于區(qū)分滅活疫苗免疫和野毒感染?！　±媒⒑玫膔ApxⅣ-ELISA和Cps-ELISA檢測(cè)了人工發(fā)病、疫苗免疫、自然感染和臨床感染豬血清中ApxⅣ和Cps抗體水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cps-ELISA可以監(jiān)測(cè)疫苗免疫后的抗體水平，而rApxⅣ-ELISA能區(qū)分滅活疫苗免疫和野毒感染。 3.豬胸膜肺炎放線桿菌快速PC

4、R檢測(cè)　　根據(jù)GenBank中豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropeumoniae，App)外膜蛋白(OmlA)基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。App1、2、3、4、5a、5b、6、7、9型參考株均擴(kuò)增出大小為1010bp左右的片段，而對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌等均未擴(kuò)增出任何條帶。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，均得到與預(yù)