幾種分子標(biāo)記技術(shù)的建立及其在部分柿屬植物親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用.pdf

1、柿是柿科柿屬植物，我國是柿屬植物的分布中心和原產(chǎn)中心之一，擁有豐富的種質(zhì)資源。但長(zhǎng)期以來，對(duì)我國柿屬植物的種類和分布還缺乏清楚的了解，對(duì)我國柿屬植物的起源、演化和親緣關(guān)系缺乏深入的探討。本研究首次開發(fā)了柿屬植物SSR分子標(biāo)記技術(shù)，并同時(shí)采用SSR，SRAP，IRAP和REMAP四種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，分別對(duì)供試7種柿屬植物(柿；君遷子；浙江柿；油柿；金棗柿；老鴉柿；美洲柿)進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，以期從DNA水平上明確柿種間及種下的親緣關(guān)系

2、和分類地位，為柿屬植物種質(zhì)資源的科學(xué)利用提供依據(jù)。主要結(jié)果如下： 1.利用數(shù)據(jù)庫查詢的方法開發(fā)柿屬植物SSR引物。查詢GenBank，EMBI。和DDBJ數(shù)據(jù)庫中的柿屬植物核酸序列，采用Sputnik篩選包含SSR的序列，用PrimerPrimere 5.0設(shè)計(jì)SSR引物。從98條核酸序列中共計(jì)篩選到SSR引物7對(duì)，并建立起柿屬植物SSR-PCR擴(kuò)增技術(shù)體系。 2.利用ISSR技術(shù)結(jié)合抑制PCR技術(shù)開發(fā)SSR引物。使用I

3、SSR引物8條，對(duì)基因組DNA擴(kuò)增后，設(shè)計(jì)抑制PCR引物進(jìn)行染色體步行，共計(jì)開發(fā)出12對(duì)SSR．引物，其中9對(duì)表現(xiàn)較好。在GenBank上登錄序列19條。 3.采用鏈親和素與生物素之間具有很強(qiáng)的親和能力的原理，用鏈親和素磁珠富集法使用生物素標(biāo)記的探針(GA)<,10>開發(fā)柿SSR引物6對(duì)，并在GenBank上登錄6條。 4.利用自主開發(fā)的SSR標(biāo)記，選用18對(duì)SSR引物對(duì)柿屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)中采用兩種電泳方式

4、進(jìn)行檢測(cè)。有關(guān)等位基因的相關(guān)信息從PAGE膠上獲得，聚類圖構(gòu)建的數(shù)據(jù)則來源于瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方式共得到158條多態(tài)性帶，每個(gè)引物檢測(cè)的帶數(shù)從5到20條不等。6％的變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)到的等位位點(diǎn)數(shù)的變化從3到24不等，平均每個(gè)引物檢測(cè)到15個(gè)位點(diǎn)。PAGE膠上所檢測(cè)的擴(kuò)增條帶數(shù)明顯比瓊脂糖凝膠上的多。根據(jù)瓊脂糖凝膠所獲得的數(shù)據(jù)由NTSYS計(jì)算30份試材間的相似系數(shù)，結(jié)果表明供試材料的相似系數(shù)變化范圍在0.4

5、2(浙江柿和老鴉柿)到0.93(富有和松本早生)間，平均值0.79。日本柿，中國柿和近緣種間相似系數(shù)平均值分別為0.83，0.81和0.71。期望雜合度和表觀雜合度變化范圍分別為0.42-0.77和0.27-0.59。 5.利用SRAP標(biāo)記，使用文獻(xiàn)中運(yùn)用較多的7條正向引物，8條反向引物，通過正反向引物間兩兩組合，共計(jì)得到了72對(duì)引物用于擴(kuò)增，從中篩選出重復(fù)性好，譜帶清晰且穩(wěn)定的引物20對(duì)。在實(shí)驗(yàn)中反向引物序列對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響更

6、大。SRAP擴(kuò)增的片段大小從200 bp到1500 bp。每對(duì)引物組合可產(chǎn)生4～18條清晰可辨的帶。根據(jù)多態(tài)性條帶計(jì)算的相似系數(shù)表明30份材料的相似系數(shù)在0.35～0.94之間，平均值0.674。前川次郎和湘西甜柿相似系數(shù)最大為0.944。老鴉柿和沙谷一號(hào)最小為0.35。 6．根據(jù)已發(fā)表的柿屬植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)10對(duì)IRAP引物，有4對(duì)在供試材料中無擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)合ISSR引物5對(duì)，

7、從中篩選出譜帶清晰、再現(xiàn)性強(qiáng)的16個(gè)引物組合對(duì)柿屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行IRAP和REMAP分析。有些IRAP正反向引物組合能擴(kuò)增出產(chǎn)物，單獨(dú)卻不能；有些正反向引物單獨(dú)擴(kuò)增與組合擴(kuò)增結(jié)果差異較大。REMAP利用IRAP正反向引物中的任意一個(gè)與ISSR引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，與單獨(dú)進(jìn)行IRAP或ISSR分析的擴(kuò)增結(jié)果均不相同。本試驗(yàn)共擴(kuò)增出117條帶，其中多態(tài)位點(diǎn)百分率為86％。擴(kuò)增片段大小在250～2000 bp之間。供試材料的相似系數(shù)變化范圍從

8、0.48(浙江柿和老鴉柿)到0.99(次郎和前川次郎)，平均值0.79。 7．本研究采用了四種分子標(biāo)記技術(shù)，即SSR、SRAP、IRAP和REMAP對(duì)部分柿屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)后分別進(jìn)行UPGMA，主坐標(biāo)分析和Wanger簡(jiǎn)約法進(jìn)行聚類。分析結(jié)果表明不同分子標(biāo)記技術(shù)之間，以及不同的聚類方法之間所反映的材料間的遺傳關(guān)系的趨勢(shì)大致相同。三大類分子標(biāo)記均較好地把供試材料分為三大組，即“日本柿組”、“中國柿組”和“近緣種組”。

9、聚類圖所反映的親緣關(guān)系和種質(zhì)問的地理起源相一致，這表明它們有不同的遺傳背景?？赡苁情L(zhǎng)期以來在不同的地區(qū)獨(dú)立演化的結(jié)果。甜柿和澀柿，不論中國和日本原產(chǎn)種質(zhì)，在聚類時(shí)都不能明顯區(qū)別開，表明甜柿和澀柿間在遺傳背景上差別不是很大，它們間的親緣關(guān)系需要在未來的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。近緣種在用聚類圖、主坐標(biāo)散點(diǎn)圖和無根樹反映材料間的遺傳關(guān)系時(shí)，總是明顯的聚在一起，與栽培柿完全分開，其中君遷子和油柿與栽培柿的遺傳關(guān)系較近。來自湖南省湘西自治州的湘西甜柿在