輪狀病毒感染誘導MA104細胞感染相關蛋白的分析鑒定.pdf

1、輪狀病毒感染是全世界范圍內嬰幼兒腹瀉的主要病因。MA104細胞是研究輪狀病毒感染生物學的理想宿主細胞。對輪狀病毒感染后宿主細胞基因表達的變化，通過RT-PCR、Northern blotting及cDNA微陣列的方法進行了很多研究，但是蛋白質才是生命活動的最終體現者。為了揭示輪狀病毒的致病機理及宿主細胞對輪狀病毒感染的反應特點，我們用蛋白組技術對輪狀病毒感染前后胞內蛋白表達譜的變化情況進行研究。首先建立輪狀病毒感染MA104細胞模型。我

2、們代表性的選用非唾液酸(SA)依賴的人源輪狀病毒Wa株和唾液酸依賴的猿猴輪狀病毒SA11株，從對MA104細胞感染能力、胞內轉錄復制能力、誘導細胞凋亡壞死能力等方面進行觀察，確定了輪狀病毒感染MA104細胞的合適條件：輪狀病毒Wa株以MOI=2，SA11株以MOI=8感染MA104細胞12h，既能保證較高的感染率，又使宿主細胞病變不過于嚴重，細胞結構保持完整，為進行感染后細胞蛋白表達譜研究的理想選擇。 為了分析感染病毒后宿主細胞

3、蛋白表達譜的變化，用13cm pH3-11NL的IPG預制膠條做IEF，雙向電泳分析感染了輪狀病毒及模擬感染的MA104細胞蛋白譜表達情況。Wa株感染組分別可檢測出772和798個蛋白點，SA11感染組分別可檢測出1230和1312個蛋白點。通過圖像分析及膠與圖像的比對，重復3次，發(fā)現Wa株感染組，感染12h后，有14個蛋白點表達上調2倍以上，37個蛋白點表達下調50％以上；SA11株感染組，感染12h后，有24個蛋白點表達上調2倍以上

4、，29個蛋白點表達下調50％以上。而在這些上調表達的蛋白點中，Wa株感染組與SA11感染組僅發(fā)現2個在等電點及分子量接近，提示可能為相同的蛋白。鑒于輪狀病毒感染后會引起細胞蛋白表達的普遍下降，那些感染后表達反而上調的蛋白在輪狀病毒于宿主細胞相互作用中似更有意義，所以我們選擇在感染后表達上調的蛋白點用于蛋白鑒定。 為了鑒定輪狀病毒感染后宿主細胞內上調表達的蛋白質，我們采用MALDI-TOF-MS技術，并通過mascot用NCBIn

5、r數據庫進行數據庫檢索。由于考慮到MA104細胞為猿猴來源，同時選取的蛋白中可能也會有病毒表達的蛋白質，我們對每個點同時搜索了靈長類和病毒兩個庫。輪狀病毒wa株感染組，送檢11蛋白點，檢出陽性結果7個，排除蛋白質的種屬特性，其中兩個為同一蛋白HSP27，其它分別為與zeta晶體蛋白高度同源的未命名的蛋白產物(gi｜90085272)，理論上蛋白質(gi｜114583139)，環(huán)戊烷介導的運動受體(hyaluronan-mediated

6、motility receptor(RHAMM))，輪狀病毒非結構蛋白NSP3，角蛋白8。輪狀病毒SA11株感染組，送檢16個蛋白點，陽性點4個，除去種屬差異性，分別為輪狀病毒非結構蛋白NSP3，plectin1 isoform 6，cortactin-binding protein 2與leucine-zipper-like transcription regulator,1isoform 1的復合物，KRT8 protein與ret

7、iculocalbin 1的復合物。這些蛋白可能與抑制宿主蛋白表達、胞內信號傳遞、胞內代謝、病毒復制與運輸及宿主細胞發(fā)育分化相關，顯示出輪狀病毒感染后對宿主細胞的改造，使之適合于自身在胞內生存。 為了對蛋白質譜鑒定的結果進一步確認，我們選取HSP27進行驗證。Western blot顯示，在被輪狀病毒Wa株感染12后，MA104細胞HSP27表達顯著上升。用SA11感染MA104，同樣可發(fā)現HSP27表達明顯上調，這可能是由于質