Notch信號通路及轉(zhuǎn)錄因子SV40在肝癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、東南大學(xué)博士學(xué)位論文Notch信號通路及轉(zhuǎn)錄因子SV40在肝癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究姓名：范任華申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)；免疫學(xué)指導(dǎo)教師：陳平圣20110920中文摘要共同作用上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子LSF的表達(dá)，促使細(xì)胞進(jìn)入Gl／S周期，二者協(xié)同促使肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖，很有可能在很多情況下起動肝細(xì)胞的癌變。我們設(shè)計(jì)一系列的實(shí)驗(yàn)來研究Notch信號與RaS以及LSF在肝細(xì)胞癌變中的作用，為弄清肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制以及尋找新的治療肝癌方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)

2、。研究目的：研究Notch信號通路，Ras蛋白及核轉(zhuǎn)錄因子SV40在肝癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究方法：1組織標(biāo)本收集與免疫組織化學(xué)：肝癌病人組織標(biāo)本由南京市第一醫(yī)院病理科提供2008120106期間25例肝癌病人組織蠟塊，其中男性20例，女性5例。標(biāo)本通過HE染色和免疫組化標(biāo)記診斷肝癌，并依據(jù)病理及細(xì)胞學(xué)證據(jù)區(qū)分類型。2細(xì)胞系與藥物：人肝癌細(xì)胞系：HepG2，Bel一7402，QGY7703購于中科院上海細(xì)胞庫。人胚腎上皮細(xì)胞(HEK)，人

3、肝星狀細(xì)胞(HSC)由本實(shí)驗(yàn)室保存，肝細(xì)胞系L02細(xì)胞由中國藥科大學(xué)徐民饋贈。Y分泌酶抑制劑DAPT由東南大學(xué)卜曉東老師饋贈，用各種濃度的DAPT處理HepG2與L02細(xì)胞，以阻斷Notch信號的激活。3構(gòu)建HRaS_pEGFPCl，NICDlpEGFP—Cl，LSFpEGFP—Cl重組載體，然后轉(zhuǎn)染，設(shè)立陰性和陽性對照，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。4蛋白免疫印跡：利用NotchlICD(CellSi印alingTeclulolog

4、y，MA，USA)，LSF(AbcamInco叩oration，MA，USA)，H—R2us(OncogeneResearchProducts，CA，USA)andpactin(SalltaCruzBiotechnology，CA，USA)等一抗鑒定各重組載體表達(dá)蛋白及轉(zhuǎn)染效率。5熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建LSFpGL3重組載體，然后轉(zhuǎn)染，設(shè)立陰性和陽性對照，檢測熒光數(shù)值。6細(xì)胞增殖與活力檢測實(shí)驗(yàn)：用MTT實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染的HepG2與轉(zhuǎn)化