Notch與NF-κB信號(hào)通路的串話(huà)在乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生中的作用.pdf

1、目的:
　　 1.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型L02/HBx細(xì)胞。
　　 2.檢測(cè)L02/HBx細(xì)胞中，HBx 蛋白與Notch 及NF-κB的結(jié)合能力，研究HBx蛋白對(duì)Notch與NF-κB 信號(hào)通路的作用方式與機(jī)制，從信號(hào)通路這一角度探討HBx在肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制中的作用。
　　 3.檢測(cè)L02/HBx細(xì)胞中Notch 信號(hào)通路阻斷后，NF-κB的功能亞基p50、p65及抑制因子IκBαmRNA與蛋白表達(dá)

2、的改變，同時(shí)檢測(cè)NF-κB DNA結(jié)合活性的變化，探討Notch與NF-κB 信號(hào)通路在L02/HBx細(xì)胞中的串話(huà)作用機(jī)制及其在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生中的作用。
　　 方法:
　　 1.傳代培養(yǎng)由課題組林松挺前期構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)HBx的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型L02/HBx細(xì)胞。
　　 2.應(yīng)用免疫共沉淀法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L02/HBx細(xì)胞中HBx 蛋白與Notch1(NICD、Jagged1)及NF-κB (p

3、50、p65、IκBα)的結(jié)合能力，同時(shí)采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡測(cè)定L02/HBx細(xì)胞中HBx與NICD 兩種蛋白的共定位情況。
　　 3.應(yīng)用含有20μM DAPT的DMEM 培養(yǎng)L02/HBx細(xì)胞48h（DAPT組），阻斷Notch 信號(hào)通路，以含有0.05％DMSO的DMEM 培養(yǎng)L02/HBx細(xì)胞48h（DMSO組）及普通DMEM 培養(yǎng)的L02/HBx細(xì)胞作為對(duì)照組，并應(yīng)用免疫印記法檢測(cè)這三組細(xì)胞中NICD

4、 蛋白量的改變。
　　 4.應(yīng)用凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性在DAPT組、DMSO組、L02/HBx組三組細(xì)胞中的改變。
　　 5.應(yīng)用RT-實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)NF-κB (p50、p65、IκBα)mRNA在DAPT組及對(duì)照細(xì)胞DMSO組、L02/HBx組細(xì)胞中的表達(dá)；同時(shí)應(yīng)用免疫印記法檢測(cè)這三組細(xì)胞中p50、p65蛋白在胞漿和胞核中的變化及IκBα總蛋白的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1

5、.免疫共沉淀和免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L02/HBx細(xì)胞中HBx 蛋白可與NICD 結(jié)合，而不能與Jagged1、p50、p65及IκBα結(jié)合。
　　 2.應(yīng)用免疫印記法測(cè)定L02/HBx+DAPT（DAPT組）、L02/HBx+DMSO（DMSO組）、L02/HBx組三組細(xì)胞中NICD的蛋白含量，結(jié)果顯示與對(duì)照組細(xì)胞相比DAPT組細(xì)胞中NICD的蛋白含量顯著降低，而對(duì)照組DMSO與L02/HBx細(xì)胞中NICD的蛋白含量無(wú)顯著差異。

6、r>　　 3.凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性，結(jié)果顯示與對(duì)照組細(xì)胞相比DAPT組細(xì)胞中NF-κB的DNA結(jié)合活性顯著降低，而對(duì)照組DMSO組與L02/HBx組細(xì)胞中NF-κB的DNA結(jié)合活性無(wú)明顯差異。
　　 4.實(shí)時(shí)定量PCR定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NF-κB 功能亞基p65mRNA在DAPT組（0.466667±0.027285）細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于DMSO組（0.97±0.045092）和L02/HBx（1±0.049

7、329）細(xì)胞(p<0.01)；NF-κB 功能亞基p50 mRNA在DAPT組（0.43±0.01）細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于DMSO組（1.01±0.01）和L02/HBx（1±0.04）細(xì)胞(p<0.01)；相反NF-κB 抑制因子IκBαmRNA在DAPT組（1.38±0.025166）細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于DMSO組（1.006667±0.012019）和L02/HBx（0.995±0.095）細(xì)胞(p<0.01)；p50、p65及Iκ

8、BαmRNA 各自在兩組對(duì)照細(xì)胞中無(wú)顯著差異。
　　 5.免疫印記法測(cè)定各組細(xì)胞中的p50、p65及IκBα的蛋白含量，結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比DAPT組細(xì)胞中，p50 及p65蛋白在胞核中的含量顯著降低，而在胞漿中無(wú)顯著差異；IκBα總蛋白含量則顯著升高；p50和p65蛋白含量在兩組對(duì)照細(xì)胞胞漿及胞核中及 IκBα含量在兩組對(duì)照細(xì)胞總蛋白中均無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.HBx蛋白可與Notch受體胞內(nèi)段

9、NICD 直接結(jié)合，而不與其配體Jagged1結(jié)合，這種直接結(jié)合作用可激活Notch信號(hào)通路；
　　 2.Notch1信號(hào)通路的激活可以在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)NF-κB 功能亞基p50、p65的表達(dá)，下調(diào)NF-κB抑制因子IκBα的表達(dá)，促進(jìn)p50、p65蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，還可增加核蛋白NF-κB的DNA結(jié)合活性，引起下游一系列基因的活化；
　　 3.HBx不能通過(guò)與p50、p65或IκBα的結(jié)合參與NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控，