干擾素-λ對乳腺癌、食管癌及惡性間皮瘤細胞系的抗增殖作用以及增強化療藥物療效的體外研究.pdf

1、目的:目前，在世界范圍內癌癥總發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，我國每年因癌癥去世的人數約150萬。傳統(tǒng)應用手術、放療、化療等手段能夠達到一定的臨床治愈，但是仍存在一定的局限性。近年來，生物治療由于其治療的全身性、個體化等得到了臨床的認可，生物治療包括:細胞因子治療、免疫活性細胞治療、誘導分化治療、基因治療等。目前，包括干擾素-α在內的細胞因子治療腫瘤已經應用于臨床，并且取得了良好的療效。近幾年，人們發(fā)現了干擾素家族的新成員-干擾素λ，它的受體復合

2、體由特異性的IL-28Rα、IL-10Rβ鏈組成。干擾素λ與干擾素α具有相似的抗病毒、抗腫瘤細胞生長及免疫調節(jié)等作用，但與干擾素α相比，干擾素λ無明顯的骨髓抑制作用及毒副作用且其作用長效，目前干擾素λ在各項體外研究中初步顯示了抗腫瘤作用。本實驗旨在通過檢測干擾素λ受體在乳腺癌細胞系，食管癌細胞系及惡性間皮瘤細胞系中表達，并確定其對于上述細胞系是否存在明顯的增殖抑制作用，進而初步探索干擾素λ的抗癌機理及其聯合化療藥物時是否對腫瘤細胞系存在

3、協同抑制作用。此研究結果將為干擾素λ成為一種有效抗擊癌癥的新興生物治療手段提供理論依據。
　　 方法:首先采用PCR技術檢測乳腺癌231、453、MCF-7細胞，食管癌TE1、TE2、TE10、YES6、T.Tn細胞，惡性間皮瘤H2452、H2052、H226、211H、H28細胞，正常的食管上皮Het-1A細胞等14種細胞是否表達IFN-λ受體復合體;同時應用MTT技術檢測經IFN-λ處理后細胞的增殖情況;選取表達IFN-λ受

4、體且IFN-λ對細胞增殖有明顯抑制作用的細胞株，應用MTT技術檢測IFN-λ聯合應用化療藥物時，兩者是否存在協同作用;應用westernblotting技術，檢測細胞系中caspase3、PARP、caspase8等，初步探索IFN-λ的抗腫瘤增殖機制。
　　 結果:
　　 1.乳腺癌、食管癌、正常的食管上皮細胞及惡性間皮瘤細胞中干擾素-λ受體復合體的表達情況
　　 乳腺癌細胞、食管癌細胞、正常的食管上皮細胞及惡

5、性間皮瘤細胞的RT-PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳后，結果顯示:食管癌TE1、TE2、TE10、YES6、T.Tn細胞，正常的食管上皮Het-1A細胞、乳腺癌453細胞、惡性間皮瘤H2052細胞出現了與預期相符的片段，說明其表達IL-28Rα、IL-10Rβ基因，即表達IFN-λ受體復合體;而乳腺癌231、MCF-7細胞，惡性間皮瘤H2452、H226、211H、H28細胞未出現與預期相符的片段，說明其不表達IFN-λ受體復合體。提

6、示:IFN-λ受體復合體在不同細胞系中的表達具有特異性。
　　 2.IFN-λ對乳腺癌細胞、食管癌細胞、正常的食管上皮細胞及惡性間皮瘤細胞的增殖影響
　　 將以上14種細胞株分別分為5組進行培養(yǎng)，分別是無處理組，IFN-λ（1ng/ml）處理組，IFN-λ（10ng/ml）處理組，IFN-λ(100ng/ml)處理組，IFN-λ(1000ng/ml)處理組。培養(yǎng)96h后應用MTT法檢測細胞增殖情況。結果顯示，不同濃度的干

7、擾素-λ對乳腺癌231、453、MCF-7細胞、惡性間皮瘤H2452、H2052、H226、211H、H28細胞、食管癌TE1、TE2、TE10、YES6細胞、正常的食管上皮Het-1A細胞不具有增殖抑制活性，經統(tǒng)計學分析，差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;不同濃度的干擾素-λ對食管癌T.Tn細胞具有明顯的增殖抑制活性，經統(tǒng)計學分析，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;并且其增殖抑制活性在一定范圍內隨著干擾素-λ濃度的升高而增強。提示:干

8、擾素-λ的抗腫瘤增殖活性在不同細胞中表現不同。
　　 3.IFN-λ與化療藥物聯合應用時對細胞增殖的影響
　　 選取IFN-λ受體陽性且IFN-λ對其增殖抑制作用明顯的食管癌T.Tn細胞株
　　 3.1.以無處理組的細胞增殖活性為100％，單純應用IFN-λ（10ng/ml）組細胞增殖活性為93％，單純應用5-FU(10uM)組細胞增殖活性為63.5％，同時應用IFN-λ(10ng/ml)和化療藥物5-FU(10

9、uM)組細胞增殖活性為35.8％;經統(tǒng)計學分析，各組間差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 3.2.以無處理組的細胞增殖活性為100％，單純應用IFN-λ（10ng/ml）組的細胞增殖活性為96.3％，單純應用CDDP(10uM)組的細胞增殖活性為66.2％，同時應用IFN-λ（10ng/ml）和CDDP(10uM)組的細胞增殖活性為45.5％;經統(tǒng)計學分析，各組間差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 提示:IF

10、N-λ可明顯增強化療藥物5-FU或CDDP對細胞的增殖抑制活性，兩者同時應用時可產生協同作用。
　　 4.IFN-λ誘導食管癌T.Tn細胞凋亡酶的檢測
　　 4.1.IFN-λ可誘導剪切形式的caspase3蛋白增加
　　 正常細胞內，caspase3蛋白以非活性狀態(tài)存在，啟動激活時可將部分肽鏈進行剪切，轉變成剪切形式的具有激酶活性的caspase3蛋白，它是細胞凋亡程序的重要啟動者和執(zhí)行者。Western蛋白印

11、跡結果顯示:IFN-λ可顯著上調食管癌T.Tn細胞中剪切形式的caspase3蛋白表達。提示:IFN-λ通過激活caspase3誘導細胞凋亡。
　　 4.2.IFN-λ可誘導剪切形式的PARP蛋白增加
　　 PARP(polyADP-ribosepolymerase)是細胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(caspase)的切割底物。Western蛋白印跡結果顯示:IFN-λ可顯著上調食管癌T.Tn細胞中剪切形式的PARP蛋白表達

12、。提示:IFN-λ通過激活PARP誘導細胞凋亡。
　　 4.3.IFN-λ可誘導活化形式的caspase8蛋白增加
　　 在正常細胞內caspase8通常以酶原的形式存在，在細胞凋亡的信號轉導過程中被激活。Western蛋白印跡結果顯示:IFN-λ可顯著上調食管癌T.Tn細胞中剪切形式的caspase8蛋白表達。提示:IFN-λ通過激活caspase8誘導細胞凋亡。
　　 結論:
　　 1.IFN-λ受體