MUC1對食管癌細胞生長及其化療藥物治療食管癌效應的影響.pdf

1、MUC1粘蛋白(簡稱MUC1)是一種高分子量Ⅰ型跨膜糖蛋白，它的跨膜序列如棒狀插入細胞膜，其主要結(jié)構是由多肽骨架和O-糖甘鍵連接的糖基側(cè)鏈構成。在正常情況下，主要廣泛分布于機體各黏膜表面，包括消化道、呼吸道、乳腺、卵巢、泌尿生殖道等的腺上皮細胞管腔頂端，起到潤滑和保護上皮細胞免受外界侵襲作用。
　　食管癌，一種由食管黏膜上皮或腺體發(fā)生的惡性腫瘤，目前已成為消化道最常見的惡性腫瘤之一。在本次的研究中我們使用MUC1-siRNA穩(wěn)定沉

2、默的Ec1.71細胞株觀察MUC1對食管癌細胞增殖和侵襲功能的影響，然后使用裸鼠荷瘤模型調(diào)查其對體內(nèi)腫瘤生長的影響和對常規(guī)化療藥物5－FU、紫杉醇和順鉑治療腫瘤作用的影響，并最終初步探討其可能的機理。為臨床上伴有MUCl過表達的食管癌患者的選擇性化療用藥或個體化化療用藥提供實驗參考。
　　二、研究內(nèi)容：
　?。ㄒ唬㎝UC1靶向小干擾RNA沉默對食管癌Ec1.71細胞的影響
　　1.MUC1穩(wěn)定沉默細胞株驗證。
　

3、　2.MUC1對Ec1.71細胞增殖的影響。
　　3.MUC1對Ec1.71細胞體外成瘤能力的影響。
　?。ǘ┏聊琈UC1分子對食管癌裸鼠移植腫瘤的影響
　　1.食管癌Ec1.71細胞移植腫瘤在體內(nèi)的生長情況。
　　2.對接種在體內(nèi)的MUC1-siRNA穩(wěn)定沉默的食管癌Ec1.71細胞中MUC1蛋白表達的影響。
　　3.MUC1分子對食管癌Ec1.71細胞移植瘤生長的影響。
　?。ㄈ㎝UC1分子對

4、5-氟尿嘧啶和順鉑化療食管癌效果的影響
　　1.MUC1分子沉默或過表達對種植腫瘤形成的影響。
　　2.5-FU和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響。
　　3.5-FU和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響；
　?。ㄋ模㎝UC1分子對紫杉醇和順鉑化療食管癌效果的影響
　　1.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響。
　　2.紫杉醇和順鉑對M

5、UC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響。
　　3.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤增殖調(diào)控因子Ki-67及凋亡調(diào)控因子Bcl-2表達影響。
　　（五）MUC1分子對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響
　　1.MUC1分子對PCNA表達的影響。
　　2.MUC1分子對Bax和Bcl-2凋亡相關蛋白表達的影響。
　　3.MUC1分子對細胞色素c釋放的影響。
　　4.MUC1分子對casp

6、ase-3蛋白的表達影響。
　　三、試驗方法：
　　（一）細胞培養(yǎng)：人食管癌細胞Ec1.71在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液隔天更換。
　?。ǘ┹d體MUC1-siRNA構建：由上海交通大學醫(yī)學院細胞分化與凋亡實驗室提供。
　?。ㄈ┘毎D(zhuǎn)染：將Ec1.71細胞以濃度為2×105接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)，細胞融合度達到大于60%是開始準備轉(zhuǎn)染，細胞用無血血清的培養(yǎng)

7、基并加入轉(zhuǎn)染復合物在37℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24小時換位正常的細胞培養(yǎng)基；細胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時，觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　?。ㄋ模￤esternblot:將細胞完全收集，然后提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉蛋白、孵一抗、孵二抗、曝光，以分析細胞中靶蛋白的表達水平。
　　四、結(jié)果：
　?。ㄒ唬㎝UC1靶向小干擾RNA沉默對食管癌細胞Ec1.71的影響
　　1.MUC1穩(wěn)定沉默細胞株驗證：應用Western blot方法對上海交通大學醫(yī)

8、學院細胞分化與凋亡實驗室提供的MUC1穩(wěn)定沉默的Ec1.71細胞株內(nèi)MUC1蛋白的表達程度進行檢測，結(jié)果顯示MUC1分子在Ec1.71細胞內(nèi)可被完全沉默。
　　2.沉默MUC1的表達可以降低Ec1.71細胞的增殖：利用MTT方法對Ec1.71細胞的的生長能力進行了評估，結(jié)果顯示Ec1.71/MUC1-siRNA細胞的生長速度與Ec1.71/CTL-siRNA細胞比較出現(xiàn)顯著的降低。
　　3.沉默MUC1的表達可以有效的抑制E

9、c1.71細胞在體外的成瘤能力；利用軟瓊脂克隆法對MUC1-siRNA沉默MUC1的Ec1.71細胞外腫瘤形成能力進行評價，Ec1.71/MUC1-siRNA細胞克隆形成率的數(shù)量和大小顯著低于對照組所形成的細胞克隆率。
　?。ǘ┏聊琈UC1分子對食管癌裸鼠移植腫瘤的影響
　　1.食管癌Ec1.71細胞能在裸鼠體內(nèi)正常成瘤：裸鼠在接種到食管癌Ec1.71細胞，第11天接種裸鼠皮下可出現(xiàn)直徑約為0.5cm×0.5cm大小的質(zhì)韌

10、結(jié)節(jié)，實驗結(jié)束是荷瘤裸鼠生長狀況良好，無一死亡。
　　2.MUC1-siRNA有效的抑制體內(nèi)接種的Ec1.71細胞內(nèi)MUC1的表達：使用MUCI-siRNA穩(wěn)定沉默MUC1分子的Ec1.71細胞在體內(nèi)的成瘤組織細胞的MUC1蛋白的表達與對照組比較顯著降低甚至消失。
　　3.MUC1分子對食管癌腫瘤的生長具有抑制作用：MUC1-siRNA轉(zhuǎn)染的Ec1.71細胞在體內(nèi)形成的瘤組織顯著低于對照組CTL-siRNA轉(zhuǎn)染Ec1.71細

11、胞所形成的瘤組織。
　?。ㄈ㎝UC1分子對5-氟尿嘧啶和順鉑治療食管癌效果的影響：
　　1.MUC1分子在體內(nèi)植腫瘤形成中起到重要作用：MUC1分子沉默后形成的腫瘤大小顯著小于MUC1分子過表達時所形成的。
　　2.5-FU和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默組，5-FU可以使裸鼠體重增加；在MUC1過表達組，5-氟尿嘧啶可以使裸鼠體重稍有增加，而順鉑使裸鼠體重顯著減少。

12、>　　3.5-FU和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默裸鼠5-FU及順鉑組均未看到明顯的腫瘤體積抑制效應；在MUC1過表達裸鼠，觀察時間結(jié)束時5-FU腫瘤體積抑瘤率為11.7%，順鉑腫瘤體積抑瘤率為32.8%。
　　（四）MUC1分子對紫杉醇和順鉑化療食管癌效果的影響
　　1.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默組，紫杉醇可以使

13、裸鼠體重稍有增加；在MUC1過表達組，紫杉醇及順鉑都可以使裸鼠體重減少，紫杉醇對裸鼠體重影響小于順鉑。
　　2.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默裸鼠，紫杉醇及順鉑組均未看到明顯的腫瘤體積抑制效應；在MUC1過表達裸鼠，觀察時間結(jié)束時紫杉醇腫瘤體積抑瘤率為23.1%，順鉑腫瘤體積抑瘤率為32.8%。
　　3.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達/穩(wěn)定沉默種植瘤增殖調(diào)控因子K

14、i-67及凋亡調(diào)控因子Bcl-2表達影響不同：Ki-67組織染色顯示在紫杉醇與順鉑處理組，增殖調(diào)控因子Ki-67呈下調(diào)趨勢；Bcl-2組織染色顯示，在紫杉醇與順鉑處理組，凋亡調(diào)控因子Bcl-2呈上調(diào)趨勢。
　?。ㄎ澹㎝UC1分子對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響：
　　1.MUC1過表達／穩(wěn)定沉默對腫瘤組織內(nèi)PCNA表達的影響不同：在MUC1過表達的腫瘤組織內(nèi)PCNA表達的陽性細胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤組織中的比較顯著提高。

15、>　　2.MUC1過表達／穩(wěn)定沉默對腫瘤組織內(nèi)Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達的影響不同：在MUC1過表達的腫瘤組織內(nèi)Bax蛋白表達的陽性細胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤組織中的顯著降低；而在MUC1過表達的腫瘤組織內(nèi)Bcl-2蛋白表達的陽性細胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤組織中的比較顯著提高。
　　3.MUC1過表達／穩(wěn)定沉默對腫瘤組織內(nèi)細胞色素c釋放的影響不同：在MUC1過表達的腫瘤組織內(nèi)細胞色素c釋放的陽性細胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤

16、組織中的比較顯著降低。
　　五、討論：
　　本次實驗我們首先觀察MUC1分子穩(wěn)定沉默后Ec1.71食管癌細胞增殖速度和侵襲能力的影響，接著將MUC1穩(wěn)定沉默的EC1.71食管癌接種在裸鼠體內(nèi)檢測MUC1分子對體內(nèi)的生長影響，并與MUC1高表達的C-7食管癌細胞進行對比性研究，觀察MUC1蛋白對目前一線的抗腫瘤化療藥物5-FU、紫杉醇和順鉑治療腫瘤的效果的影響，為臨床上食管癌的治療提供一個初步的用藥參考。最后我們將初步探討MU

17、C1過表達和沉默時對腫瘤細胞增勢和凋亡的影響，實驗結(jié)果顯示MUC1分子沉默后食管癌Ec1.71細胞的增勢能力和侵襲能力都減弱，將MUC1分子沉默的食管癌Ec1.71細胞接種于裸鼠體內(nèi)，形成腫瘤的生長情況于體外實驗相似，腫瘤組織生長速度與對照組比較顯著緩慢。
　　5-FU是細胞周期性特異阻斷藥物,其功能是抑制DNA的合成，使細胞不能完成腫瘤分裂過程，最終抑制腫瘤的增長，促使細胞發(fā)生凋亡；紫杉醇是新型抗微管藥物，通過促進微管蛋白聚合，

18、保持微管蛋白穩(wěn)定，抑制細胞有絲分裂，使細胞中止于對放療敏感的G2和M期；順鉑，通過形成DDP～DNA復合物，干擾DNA復制，細胞阻滯于S期，不能進人G2/M期，增殖受抑，啟動細胞凋亡，這些藥物對腫瘤的抑制作用基本是通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞增勢和凋亡過程來實現(xiàn)的。因此，我們在本次研究中初步探討了MUC1分子過表達和沉默后對體內(nèi)腫瘤細胞增殖和凋亡的影響，為其更為深入的機制研究進行一定的理論鋪墊，也為臨床上食管癌腫瘤的個體化治療及化療藥物的選擇提供了