腺相關(guān)病毒介導(dǎo)KiSS-1基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 構(gòu)建KiSS-1基因腺相關(guān)病毒載體并轉(zhuǎn)染并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)KiSS-1的骨肉瘤MG-63細(xì)胞株，檢測(cè)KiSS-1基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步研究腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)KiSS-1基因體外轉(zhuǎn)染后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、粘附、趨化運(yùn)動(dòng)的影響。 方法： 1、KiSS-1腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建。 2、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法介導(dǎo)KiSS-1基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞株。 3、RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后后KiSS-1基因轉(zhuǎn)

2、錄水平，Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后蛋白的表達(dá)。 4、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力變化。 5、Tmnswell小室、Millicell法、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后MG63增殖、侵襲、趨化運(yùn)動(dòng)、粘附能力的變化。 結(jié)果： 1、KiSS-1腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建：胎盤組織抽提總RNA并通過(guò)RT-PCR獲得目的基因ORF，經(jīng)TA克隆將目的基因連入PSNAV2中，送測(cè)序結(jié)果無(wú)誤。 2、陽(yáng)性脂質(zhì)

3、體法介導(dǎo)KiSS-1基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞株，經(jīng)G418抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)KISS-1的MG-63細(xì)胞株。 3、轉(zhuǎn)染前后的：MG63細(xì)胞株的KISS-1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平有明顯差異。 4、轉(zhuǎn)染KiSS-1基因的MG-63細(xì)胞較其親代細(xì)胞增殖能力明顯降低。 5、轉(zhuǎn)染KiSS-1基因的MG-63細(xì)胞較其親代腫瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。 6、穩(wěn)定表達(dá)KiSS-1基因的MG63細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、層粘連蛋

4、白FN、細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel的粘附能力明顯下降。 7、穩(wěn)定表達(dá)KiSS-1的MG-63細(xì)胞較KiSS-1表達(dá)缺陷的MG-63細(xì)胞遷移能力明顯降低。 結(jié)論： 1、利用脂質(zhì)體將KiSS-1基因轉(zhuǎn)染到骨肉瘤MG63細(xì)胞是可行、有效、穩(wěn)定的。 2、PSNAV2.0-KISS-1能夠介導(dǎo)目的基因在在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定、高效地表達(dá)。 3、轉(zhuǎn)染KiSS-1基因的骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖能力明顯受抑制。