跨膜蛋白P190胞外段互作蛋白的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、背景及目的
　　 P190蛋白是一種神經(jīng)元跨膜蛋白,由1384個(gè)氨基酸組成。最初發(fā)現(xiàn)于有髓神經(jīng)纖維郎飛氏節(jié)的節(jié)旁側(cè),主要在脊椎動物腦內(nèi)表達(dá),另外在卵巢、胰臟、腸、肺、心臟及睪丸等組織內(nèi)也有少量表達(dá)。P190蛋白與髓鞘蛋白NF155等結(jié)合,在神經(jīng)軸突的節(jié)旁側(cè)形成節(jié)旁連接(paranodal junction),這種連接結(jié)構(gòu)類似于間隔連接(septate junction)。間隔連接廣泛存在于果蠅等無脊椎動物的血-神經(jīng)屏障處,與脊椎

2、動物血腦屏障處的緊密連接功能類似。目前研究表明,脊椎動物內(nèi)由P190、NF155等蛋白形成的節(jié)旁連接在維持神經(jīng)沖動的跳躍式傳導(dǎo)、軸突-膠質(zhì)細(xì)胞間信息快速傳遞、軸突特化區(qū)域的形成及軸-膠間隙與細(xì)胞外基質(zhì)間屏障形成中發(fā)揮重要作用。P190蛋白表達(dá)異?？僧a(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂,P190-/-型小鼠的神經(jīng)沖動傳導(dǎo)速度明顯低于正常小鼠,而且在出生后不久即因神經(jīng)元變性壞死而導(dǎo)致死亡。另外有研究顯示多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosi

3、s,MS)患者腦內(nèi)P190表達(dá)水平明顯降低。P190表達(dá)降低可進(jìn)一步導(dǎo)致髓鞘脫離軸突,促進(jìn)軸突變性壞死,進(jìn)而形成神經(jīng)元變性損傷的惡性循環(huán)。在糖尿病性神經(jīng)病變的大鼠中,P190的表達(dá)水平也明顯降低。由此可見,P190蛋白的功能是至關(guān)重要的,但其具體功能和作用機(jī)制還不清楚。
　　 血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、基膜及周細(xì)胞等共同組成的高度特化的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)單元。其中腦微血

4、管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接和粘附連接是構(gòu)成血腦屏障結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),也是維持血腦屏障功能的關(guān)鍵。目前已知的內(nèi)皮細(xì)胞間連接相關(guān)蛋白已有很多,包括跨膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白;同時(shí)對內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接和粘附連接的作用機(jī)制也有了深入認(rèn)識,但仍有待發(fā)現(xiàn)更多的連接蛋白及更深入的了解內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能機(jī)制。
　　 我室研究人員發(fā)現(xiàn)P190蛋白除了在神經(jīng)軸突有表達(dá)外,在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)內(nèi)也有大量表達(dá)?；诖?本研究通過利用酵母雙雜交的方法,

5、篩選與P190的胞外段蛋白互作的蛋白,期望找出P190對內(nèi)皮細(xì)胞功能作用的機(jī)制。
　　 方法
　　 1、酵母雙雜交法篩選P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)的相互作用蛋白。
　　 2、在酵母中再驗(yàn)證P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)與cystatinC的相互作用。
　　 3、P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 4、GST-cystatinC融合蛋白的表達(dá)

6、和純化。
　　 5、利用GST-pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)與cystatinc相互作用。
　　 6、利用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀方法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)與cystatinC相互作用。
　　 7、免疫共沉淀方法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)與cystatinc相互作用。
　　 8、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染。
　　 9、蛋白

7、質(zhì)免疫印跡(Western-blot)。
　　 10、免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果
　　 1、酵母雙雜交方法篩選出P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)的相互作用蛋白cystatinC。
　　 2、酵母共轉(zhuǎn)驗(yàn)證方法驗(yàn)證P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250aa)與cystatinc相互作用。
　　 3、在293T細(xì)胞中驗(yàn)證cystatinc和P190結(jié)構(gòu)域存在相互作用。
　　 (1)免

8、疫沉淀(IP)驗(yàn)證cystatinc與p190相互作用。
　　 (2)免疫熒光共聚焦結(jié)果。
　　 4、在人腦為血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)中驗(yàn)證cystatinc和P190結(jié)構(gòu)域存在相互作用。
　　 (1)GST-pulldown證實(shí)cystatinc和P190結(jié)構(gòu)域可相互結(jié)合。
　　 (2)在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)中驗(yàn)證沒有cystatinc的存在。獲得高表達(dá)P190結(jié)構(gòu)域(812aa-1250