蘇云金芽胞桿菌aiiA基因轉(zhuǎn)化石斛蘭的研究.pdf

1、石斛蘭(Dendrobium)是國際花卉市場上最受歡迎的蘭花切花和盆花品種之一，但其易受細(xì)菌性軟腐病侵染，令生產(chǎn)者蒙受巨大損失。蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)的aiiA基因編碼的AiiA蛋白能降解N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactones，AHLs)，可以明顯抑制馬鈴薯軟腐病的發(fā)生。使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入外源抗病基因是目前蘭花抗病育種的新方向，但目前的蘭花遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)還不成熟

2、。本論文以石斛蘭大熊貓1號(D．Ekapol‘PANDA No．1’)為材料，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將Bt的aiiA基因轉(zhuǎn)入石斛蘭，并對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，以研究研的AiiA蛋白對防治石斛蘭軟腐病的影響，并提高石斛蘭的轉(zhuǎn)化效率。 本研究通過PCR方法從Bt中克隆了aiiA基因，在雙元轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(含有潮霉素選擇標(biāo)記基因)基礎(chǔ)上構(gòu)建了分別受花椰菜花葉病毒35S(CauliflowerMosaic’Virus 35S

3、 promoter,CaMV 35S)啟動子和玉米泛素啟動子(maize ubiquitinpromoter)控制的表達(dá)載體pSAN和pUAN，以期比較這兩種啟動子在轉(zhuǎn)基因石斛蘭中的表達(dá)效果。 將pSAN和pUAN分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或EHA105，獲得了4種工程菌，并比較了它們轉(zhuǎn)化石斛蘭的效率。GUS瞬時表達(dá)結(jié)果表明，帶有pSAN或pUAN的EHA105均能比帶有pSAN或pUAN的LBA4404更有效地轉(zhuǎn)化石斛蘭。

4、 使用含有pSAN和pUAN的EHA105轉(zhuǎn)化石斛蘭，經(jīng)過了4個月的選擇培養(yǎng)，已獲得一批潮霉素抗性的石斛苗。對部分抗性苗的葉片進(jìn)行了GUS染色，結(jié)果表明該基因已穩(wěn)定表達(dá)。用含有pUAN的EHA105轉(zhuǎn)化石斛蘭，研究了不同菌液濃度(OD<,600>)、侵染液添加或不添加乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)對轉(zhuǎn)化效率的影響。GUS瞬時表達(dá)結(jié)果表明，只有當(dāng)農(nóng)桿菌生長至OD<,600>值為0.8時，添加AS能略為提高轉(zhuǎn)化效率，