蘇云金芽胞桿菌資源多樣性分析與殺蟲基因發(fā)掘.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），革蘭氏陽性細菌，在芽胞形成期可產(chǎn)生具有殺蟲活性的伴胞晶體。Bt晶體主要由cry基因編碼的殺蟲晶體蛋白組成，在害蟲的防治中具有重要作用，有巨大的商業(yè)價值，因此發(fā)掘新基因并進行知識產(chǎn)權(quán)保護是Bt資源研究的重要內(nèi)容。知識產(chǎn)權(quán)作為綜合競爭力的重要體現(xiàn)，而目前我國在Bt殺蟲基因資源的知識產(chǎn)權(quán)方面處于劣勢，大部分Bt殺蟲基因的專利權(quán)掌握在西方各大型農(nóng)業(yè)生物技術(shù)企業(yè)手中，我國掌握的

2、Bt新的基因發(fā)明專利不足60項。高通量測序技術(shù)的發(fā)展為發(fā)掘殺蟲基因提供了新思路，成為國內(nèi)外發(fā)掘Bt殺蟲基因的主要手段。但是測序價格較高，Bt資源庫中存在的冗余菌株會造成較大的資金浪費，目前尚沒有便捷的方法去除重復(fù)菌株。因此，迫切需要建立可以快速分析比較大量樣品的方法，來排除重復(fù)菌株，進一步提高殺蟲基因發(fā)掘效率。
　　 本論文在分離1500株Bt菌株的基礎(chǔ)上，進一步建立了菌株多樣性分析方法，對菌株多樣性進行研究，去除冗余菌株，對其

3、中90株菌株進行了殺蟲基因測序篩選，主要結(jié)果如下:
　　 Bt菌株分離與鑒定:殺蟲活性評估結(jié)果顯示多數(shù)菌株對鱗翅目害蟲有較高活性，1500株測試菌株中，對棉鈴蟲有活性的菌株有1346株，對玉米螟有活性菌株有813株，而對葉甲類害蟲大猿葉甲有活性的菌株較少，只有42株;鏡檢結(jié)果顯示不同菌株產(chǎn)生的晶體形狀、大小、種類有較大差異，晶體種類主要為菱形，部分為球形和不規(guī)則的晶體形狀;殺蟲晶體蛋白圖譜顯示大部分菌株表達了130kD蛋白，部分

4、菌株還表達了100Kd、60kD蛋白，具有典型Bt殺蟲晶體蛋白的特征;質(zhì)粒圖譜顯示不同菌株質(zhì)粒圖譜條帶數(shù)量和大小都有所不同，并且有部分菌株圖譜相似，說明資源庫中有冗余菌株。
　　 建立Bt菌株多樣性分析方法:首先，設(shè)計了可以擴增多個基因家族的兼并引物，fastPCR軟件分析結(jié)果顯示該引物可以對超過30種的殺蟲基因家族進行較好的擴增，PCR實驗檢測顯示，該引物可以擴增出預(yù)期條帶但是條帶較弱。進一步通過增加側(cè)翼特異序列的辦法對兼并引

5、物進行改良，改良后的引物顯著提高了擴增效率。同時，還對引物濃度與退火溫度進行了優(yōu)化，利用72個不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌對優(yōu)化后的PCR體系進行了評估，結(jié)果顯示95％以上的菌株都可以獲得預(yù)期條帶;利用含有多個基因的HD12菌株評估了優(yōu)化后體系對多個基因同時擴增的能力，結(jié)果顯示優(yōu)化后的PCR可以從HD12獲得9種不同的RFLP類型。這些結(jié)果說明優(yōu)化后的PCR體系具備了cry基因指紋圖譜的基本要求。此外，本論文還對Bt基因組提取方法進行了改良，改良

6、后的方法可以提取并獲得質(zhì)量均一的基因組DNA。用改良的PCR體系對Bt基因組進行擴增，并用HinfI對PCR產(chǎn)物進行消化，利用LabChip GX電泳系統(tǒng)進行分析，獲得了888個菌株的RFLP圖譜。進一步對電泳圖譜進行數(shù)字化、計算相似性、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹分析。結(jié)果顯示，該方法可以有效分析菌株多樣性，去除冗余菌株，獲得可用于進一步基因發(fā)掘的菌株。
　　 90株Bt菌株殺蟲基因測序篩選:利用高通量測序技術(shù)分析了90株不同的Bt菌株的序