雅安周公山蘇云金芽胞桿菌基因資源研究和殺蟲基因的克隆.pdf

1、本研究從四川雅安周公山原始森林土壤中采集土壤350份，應用醋酸鈉-抗生素法篩選出132株蘇云金芽胞桿菌菌株，出菌率為11％。初步研究發(fā)現(xiàn)這些蘇云金芽胞桿菌的伴孢晶體類型有菱形、方形、球形、無定形等，充分體現(xiàn)了我國菌株資源的多樣性。因此我們對雅安周公山蘇云金芽胞桿菌基因資源進行了初步的研究和部分殺蟲基因的克隆，主要結(jié)果如下： 1、通過對采集的350份土壤的海拔、資源、氣候等地理特征分析，總結(jié)出了Bt資源的分布規(guī)律：在海拔1742米

2、下，不同海拔高度的Bt出菌率經(jīng)差異顯著性分析后顯示其無明顯差異；腐質(zhì)土比黏土高、黏土又高于沙土；植被覆蓋率高的地區(qū)，生態(tài)條件優(yōu)越，Bt分離率高；土壤表面腐質(zhì)層越厚，土壤所含腐殖質(zhì)越豐富，Bt含量越多；山脈陽坡出菌率比陰坡高。 2、對這132株Bt野生菌的伴孢晶體蛋白進行了SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示殺鱗翅目、鞘翅目和雙翅目的殺蟲蛋白帶最豐富，顯示了周公山Bt菌的殺蟲蛋白具有一定的特異性。 3、對132株Bt野生菌的cr

3、y基因進行了PCR-RFLP分析鑒定，發(fā)現(xiàn)含cry1型基因菌株有74株，cry2型為34株，cry7型16株，cry9型16株，cry3型13株，cry4型8株，cry30型7株，cry8型2株，cry4型2株，另外有46株菌含未知基因，占34.8％。結(jié)果顯示cry1基因含量最豐富，cry2基因其次，cry9和cry3基因第三。 4、克隆了cry9Ea4基因(Accessionnumber:EU760456)。該基因的核苷酸序列

4、為3468bp，與已報道的cry9Ea序列同源性高達99％。經(jīng)國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會正式命名為cry9Ea4。 5、對132株Bt野生菌vip3基因進行了PCR分析鑒定，發(fā)現(xiàn)有25株菌含Vip3A基因，出菌率為19％；另外有4株菌含新Vip3基因。 6、克隆了vip3A基因的部分序列。 7、對菌株ZG5-4、HY3-2進行了菌種鑒定：ZG5-4定名為蘇云金芽胞桿菌臘螟變種(Bacillusthingi

5、ensisvargalleriae)；HY3-2菌株定名為蘇云金芽胞桿菌殺蟲變種(Bacillusthringionsisvarentomocidus)。 8、對菌株ZG5-4和菌株HY3-2進行了抗蟲生物活性測定。結(jié)果表明菌株ZG5-4對鱗翅目的甜菜夜蛾、棉玲蟲初孵幼蟲有毒力，LC50分別為23.42ng/mL和13.24ng/mL，而菌株HY3-2對甜菜夜蛾、棉玲蟲初孵幼蟲的LC50分別為21.17ng/mL和14.07ng