星形膠質(zhì)細(xì)胞通過Cx43參與ATP介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的研究.pdf

1、目的：利用雙光子顯微鏡和綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠在體觀察細(xì)胞活動(dòng)的優(yōu)勢(shì),以顱腦開窗和離體腦組織切片兩種方法考察腦內(nèi)MI對(duì)局部ATP刺激之后的反應(yīng),以及應(yīng)用縫隙連接蛋白抑制劑Carbcnoxalone(CBX)對(duì)這一過程的影響來探討星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與ATP的釋放。
　　 利用經(jīng)典的致炎因子脂多糖(Lipopolysacchiride,LPS)作為MI的外周免疫激活劑,

2、考察LPS腹腔注射24小時(shí)后,MI的活化和Cx43的表達(dá)變化,同時(shí)觀察可能與MI急性期活化密切相關(guān)的P2Y12受體在腹腔注射LPS后的表達(dá)變化。
　　 方法：
　　 1、轉(zhuǎn)基因小鼠在體模型建立:選用6-8w的成年CX3CR1/GFP雜合小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,于雙光子顯微鏡下存圖。
　　 2、活腦組織切片制備:采用6-8w的成年CX3CR1/GFP雜合小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,在ACSF的冰水混合物中快速斷頭,迅速完整取出大腦

3、組織,于振蕩切片機(jī)切400um切片后分別置于ACSF或含刺激物的孵育系統(tǒng)中。切片在雙光子顯微鏡下存圖或孵育90分鐘后多聚甲醛固定備用。
　　 3、在體觀察MI突起活動(dòng):選用910nm波長(zhǎng),強(qiáng)度在30-40mw之間的激光作為MI存圖默認(rèn)參數(shù),在距離腦表面150um以下的視野作為存圖區(qū),在Fluoview300軟件系統(tǒng)中存XYT模式動(dòng)態(tài)圖像。
　　 4、離體切片共聚焦顯微鏡存圖:選用Cy2激光,在固定激光強(qiáng)度下和固定的FLu

4、oview300軟件參數(shù)情況下存取XYZ模式圖像。
　　 5、Cx43KO小鼠及野生小鼠LPS腹腔注射模型的建立:選用6-8w的KO和WT小鼠,LPS或生理鹽水腹腔注射,于24小時(shí)后,或4％多聚甲醛灌流固定后取出腦組織,或直接快速取腦冷凍后用于WesternBlot分析。
　　 6、Cx43、GFAP、Ibal免疫熒光染色7、Cx43、IL-1β、P2Y12受體Western blot8、各組間差異的比較應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)。

5、
　　 結(jié)果：
　　 1、顱腦開窗在體觀察MI活動(dòng):MI的突起時(shí)刻向各個(gè)方向運(yùn)動(dòng)；當(dāng)局部發(fā)生激光損傷時(shí),鄰近MI突起的運(yùn)動(dòng)方向一致伸向損傷區(qū)；局部給予ATP刺激能夠模擬激光損傷對(duì)MI突起的趨向性；激光損傷對(duì)MI突起的趨化作用可以被預(yù)先給予的250uMCBX所拮抗;激光損傷前預(yù)先給予經(jīng)典的P2X7受體拮抗劑BBG,不能抑制激光損傷后MI突起的運(yùn)動(dòng)。
　　 2、離體活組織切片不同組孵育結(jié)果:切片所造成的損傷能夠使MI

6、突起向損傷區(qū)伸展,CBX能夠抑制這種損傷所造成的趨向性,而ATP能夠加強(qiáng)這種趨化作用。
　　 3、Cx43在不同組別之間免疫染色和Westernblot分析結(jié)果:Cx43在KO-NS組和KO-LPS組均無表達(dá),在WT-NS組有微弱表達(dá),與GFAP共染后可見Cx43與GFAP有部分重疊。在WT-LPS組Cx43表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 4、Ibal和GFAP免疫熒光在各組之間比較:在WT-LPS組和KO-LPS組,Ibal和G

7、FAP的表達(dá)均較NS兩組增強(qiáng),MI和星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)活化。
　　 5、P2Y12受體和IL-1β的WesternBlot分析:LPS腹腔注射后腦內(nèi)P2Y12受體表達(dá)增強(qiáng),WT-LPS組較KO-LPS組表達(dá)更強(qiáng)；LPS腹腔注射后腦內(nèi)IL-1β表達(dá)增強(qiáng),WT-LPS組較KO-LPS組表達(dá)更強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 1、局部ATP刺激能夠活化MI。
　　 2、CBX能夠抑制激光損傷和ATP刺激對(duì)MI的活化。