多殺菌素產(chǎn)生菌的基因組重排育種.pdf

1、多殺菌素(spinosyn)是由刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的一類新型大環(huán)內(nèi)酯類化合物。它是一種低毒、低殘留、對昆蟲天敵安全、作用機(jī)理獨特的天然殺蟲劑。本試驗通過建立刺糖多孢菌原生質(zhì)體制備再生最佳條件，運(yùn)用抗性耐受突變及基因組重排技術(shù)，開展了刺糖多孢菌高產(chǎn)多殺菌素的菌株選育工作。 試驗結(jié)果顯示S.spinosa原生質(zhì)體制備的最佳條件為250ml三角瓶(帶有不銹鋼彈簧)裝50ml含1

2、0％蔗糖的TSB培養(yǎng)基、孢子懸液接種，28℃，200r/min培養(yǎng)48h；3000r/min收集菌絲體并用0.3mol/L蔗糖清洗一次；用含3mg/mL溶菌酶P緩沖液懸浮菌絲體，32℃下處理100min；M-G培養(yǎng)是最合適的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基；原生質(zhì)體可在-70℃保存。 以刺糖多孢菌N229-17(多殺菌素產(chǎn)量334μg/mL)和C131-24(多殺菌素產(chǎn)量279μg/mL)為出發(fā)菌株，進(jìn)行原生質(zhì)體亞硝酸和微波誘變，篩選Str+

3、和Gen+抗性菌株，結(jié)果顯示菌株的抗性水平與多殺菌素產(chǎn)量呈正相關(guān)，并得到了菌株Y23(Str+Gen-)和W16(Str-Gen+)。通過Y23和W16進(jìn)行原生質(zhì)體融合研究試驗，結(jié)果顯示40％的PEG1000對原生質(zhì)體融合有很好的促進(jìn)作用。以Y23、W16、P131、U108-41和N613為親本菌株進(jìn)行基因組重排研究，結(jié)果顯示隨著重排深入，高產(chǎn)菌株出現(xiàn)頻率增加。通過3輪Genomeshuffling處理，篩選獲得菌株F113(528μ