基因組重排技術(shù)在草菇耐低溫菌株選育上的應(yīng)用.pdf

1、草菇(Volvariella volvacea)作為一種大面積栽培的食用菌,存在著不耐低溫的問(wèn)題:在4℃條件下保存時(shí),菌絲體會(huì)發(fā)生自溶而死亡,子實(shí)體會(huì)發(fā)軟、液化直至腐爛,這給草菇菌種的保存和產(chǎn)后的保鮮帶來(lái)了極大的困難。本文首次通過(guò)基因組重排技術(shù),采用雙親滅活標(biāo)記,經(jīng)過(guò)低溫篩選成功選育出3株正常出菇的草菇耐低溫菌株。
　　本文通過(guò)對(duì)草菇原生質(zhì)體制備和再生條件的優(yōu)化、草菇突變體庫(kù)的構(gòu)建、雙親滅活遞歸式原生質(zhì)體的融合、耐低溫重排子的篩選

2、,獲得如下主要研究結(jié)果:
　　1.研究并建立了草菇原生質(zhì)體的制備和再生的最佳條件。最優(yōu)的原生質(zhì)體制備條件:選擇培養(yǎng)60h的草菇菌絲,在溶壁酶濃度為1.5％,酶解溫度32℃條件下酶解3h,并以0.6mol/L的甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑;最優(yōu)的再生條件為:選擇培養(yǎng)84h的草菇菌絲,在溶壁酶濃度為1.5%條件下酶解2h,并以0.6mol/L的甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑配制再生培養(yǎng)基,于32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.采用紫外誘變、化學(xué)誘

3、變、電子束誘變和60Co-g誘變這4種誘變方法分別對(duì)16個(gè)草菇原始菌株(耐低溫:0℃,10h)進(jìn)行誘變,通過(guò)耐低溫處理和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),最終篩選得到一個(gè)耐低溫效果明顯提高且擁有194個(gè)突變株的突變庫(kù),耐低溫性達(dá)到0℃,24h,是原始菌株耐低溫性的2.4倍。
　　3.通過(guò)對(duì)草菇原生質(zhì)體滅活條件的研究,最終確定原生質(zhì)體熱滅活的條件為50℃,3min,紫外滅活時(shí)間為110 s;然后對(duì)這兩組滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行PEG融合并對(duì)融合條件進(jìn)行優(yōu)化,得

4、到最優(yōu)的融合條件:PEG濃度為40%,pH8.0,在32℃條件下融合30min,融合率達(dá)到0.517%。
　　4.經(jīng)過(guò)4輪基因組重排,篩選得到耐低溫(0℃,48h)的第四代重排株15株(F4),其耐低溫性是原始菌株的4.8倍;并對(duì)其中遺傳穩(wěn)定性較好的9株進(jìn)行出菇實(shí)驗(yàn),最后成功出菇3株,其子實(shí)體在10℃條件下儲(chǔ)藏期分別為25 h、32 h、48h,是原始菌株中最耐低溫的V23儲(chǔ)存期的1.56、2.00、3.00倍。
　　由此可